目的:本研究以臨床分離的致綿羊腦炎單增李斯特菌(Lm90)為材料,在inlA、inlB缺失基礎(chǔ)上缺失inlJ構(gòu)建三基因缺失株(Lm90-ΔinlABJ),分析其部分生物學(xué)特性及對(duì)小鼠和綿羊的致病作用;應(yīng)用Lm90感染小鼠,分析小鼠血腦屏障(Blood brain barrier,BBB)通透性變化及發(fā)生損傷的可能作用機(jī)制,并構(gòu)建體外BBB模型進(jìn)一步驗(yàn)證炎性因子對(duì)小鼠BBB損傷的影響作用,為進(jìn)一步研究單增李斯特菌(Listeria monocytogenes,L.monocytogenes)的致病機(jī)理及防控李斯特菌病提供參考,也為進(jìn)一步開展其它細(xì)菌性腦膜炎病原菌感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)的研究提供一定借鑒。方法:(1)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增inlJ基因上、下游同源臂,采用重疊延伸PCR獲得缺失inlJ的融合片段ΔinlJ;構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-ΔinlJ,經(jīng)電轉(zhuǎn)化至Lm90-ΔinlAB感受態(tài)細(xì)胞,在溫度及氯霉素雙重壓力下實(shí)現(xiàn)同源重組;篩選重組Lm90-ΔinlABJ,并檢測(cè)其遺傳穩(wěn)定性。(2)采用細(xì)菌學(xué)方法對(duì)比分析Lm90-ΔinlABJ、Lm90-ΔinlAB及L...

【文章頁數(shù)】：120 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞
第一章 緒論
    1 研究目的及意義
    2 國內(nèi)外研究進(jìn)展
        2.1 單增李斯特菌概述
        2.2 單增李斯特菌的生物學(xué)特性
        2.3 單增李斯特菌的致病力
        2.4 單增李斯特菌感染的致病機(jī)理
        2.5 單增李斯特菌的毒力因子及調(diào)控因子
        2.6 單增李斯特菌侵染中樞神經(jīng)系統(tǒng)研究進(jìn)展
    3 研究內(nèi)容與技術(shù)路線
        3.1 主要研究內(nèi)容
        3.2 技術(shù)路線
第二章 試驗(yàn)研究
    試驗(yàn)一 單增李斯特菌ΔinlABJ缺失株的構(gòu)建
        前言
        1 材料
            1.1 菌株及質(zhì)粒
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器設(shè)備
            1.4 引物設(shè)計(jì)
        2 方法
            2.1 inlJ上、下游同源臂的擴(kuò)增及融合
            2.2 inlJ缺失片段的克隆與測(cè)序
            2.3 重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-ΔinlJ的構(gòu)建
            2.4 Lm90-ΔinlAB感受態(tài)細(xì)胞的制備
            2.5 電轉(zhuǎn)化及Lm90-ΔinlABJ缺失株的篩選與鑒定
        3 結(jié)果
            3.1 inlJ基因上下游臂的擴(kuò)增及SOE-PCR結(jié)果
            3.2 重組質(zhì)粒pKSV7-ΔinlJ的雙酶切鑒定
            3.3 電轉(zhuǎn)后陽性轉(zhuǎn)化子篩選與鑒定
            3.4 同源重組子的篩選與鑒定
            3.5 缺失株的遺傳穩(wěn)定性鑒定
        4 討論
        5 小結(jié)
    試驗(yàn)二 單增李斯特菌Δinl ABJ缺失株部分生物學(xué)特性研究
        前言
        1 材料
            1.1 菌株、細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器設(shè)備
        2 方法
            2.1 缺失株培養(yǎng)特性及生長曲線測(cè)定
            2.2 缺失株溶血特性測(cè)定
            2.3 細(xì)胞黏附、侵襲及胞內(nèi)增殖能力測(cè)定
            2.4 小鼠存活試驗(yàn)
            2.5 半數(shù)致死量(LD50)測(cè)定
            2.6 小鼠組織載菌量測(cè)定
            2.7 綿羊感染試驗(yàn)
            2.8 數(shù)據(jù)分析
        3 結(jié)果
            3.1 培養(yǎng)特性
            3.2 生長曲線測(cè)定
            3.3 溶血測(cè)定
            3.4 細(xì)胞侵襲及胞內(nèi)增殖
            3.5 缺失株對(duì)小鼠的毒力試驗(yàn)
            3.6 小鼠LD50測(cè)定
            3.7 小鼠組織載菌量測(cè)定
            3.8 綿羊感染試驗(yàn)結(jié)果
        4 討論
        5 小結(jié)
    試驗(yàn)三 單增李斯特菌對(duì)小鼠血腦屏障損傷及其可能機(jī)制研究
        前言
        1 材料
            1.1 菌株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            1.2 主要實(shí)驗(yàn)器材
            1.3 主要試劑
            1.4 主要試劑的配制
        2 方法
            2.1 小鼠感染試驗(yàn)
            2.2 感染小鼠BBB通透性測(cè)定
            2.3 腦組織取材、固定及切片制作
            2.4 HE染色及免疫組化
            2.5 組織樣品RNA、蛋白提取
            2.6 cDNA模板制備
            2.7 SYBR Green法熒光定量PCR
            2.8 蛋白質(zhì)免疫印跡
            2.9 細(xì)胞因子測(cè)定
            2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
        3 結(jié)果與分析
            3.1 不同感染劑量小鼠存活率
            3.2 感染小鼠眼觀癥狀
            3.3 小鼠腦組織細(xì)菌回收及鑒定
            3.4 小鼠腦病理組織學(xué)觀察
            3.5 小鼠腦組織載菌量測(cè)定
            3.6 感染小鼠BBB通透性變化
            3.7 ZO-1、Occludin、Claudin-5 表達(dá)變化
            3.8 ZO-1、Occludin、Claudin-5 免疫組化測(cè)定
            3.9 單增李斯特菌感染促進(jìn)TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白水平表達(dá)
        4 討論
        5 小結(jié)
    試驗(yàn)四 炎性因子對(duì)體外血腦屏障模型損傷的影響作用研究
        前言
        1 材料
            1.1 菌株及細(xì)胞
            1.2 主要試驗(yàn)器材
            1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
            1.4 主要試劑的配制
        2 方法
            2.1 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及星型膠質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)
            2.2 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及星型膠質(zhì)細(xì)胞的免疫熒光鑒定
            2.3 體外血腦屏障模型的構(gòu)建
            2.4 體外血腦屏障模型的評(píng)估
            2.5 WB檢測(cè)體外血腦屏障模型緊密連接蛋白表達(dá)
            2.6 小鼠巨噬細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)
            2.7 單增李斯特菌感染RAW264.7 細(xì)胞
            2.8 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá)
            2.9 ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá)
            2.10 單增李斯特菌感染RAW264.7 細(xì)胞后上清制備
            2.11 感染單增李斯特菌的RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)物對(duì)BBB通透性的影響
            2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
        3 結(jié)果與分析
            3.1 鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及星型膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
            3.2 鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及星型膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光鑒定
            3.3 跨內(nèi)皮細(xì)胞間電阻(TEER)測(cè)定
            3.4 液面試漏試驗(yàn)
            3.5 辣根過氧化物酶(HRP)通透性測(cè)定
            3.6 緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5 的表達(dá)
            3.7 單增李斯特菌感染可誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞炎性因子的表達(dá)
            3.8 感染單增李斯特菌的RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)物可影響B(tài)BB的通透性
            3.9 感染單增李斯特菌的RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)物可調(diào)節(jié)BMECs緊密連接蛋白的表達(dá)
        4 討論
        5 小結(jié)
第三章 結(jié)論
第四章 創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡介
石河子大學(xué)博士研究生學(xué)位論文導(dǎo)師評(píng)閱表



本文編號(hào)：3843694