新城疫(Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的急性、高度接觸性的禽類傳染病，給世界養(yǎng)禽業(yè)造成極大的經(jīng)濟損失。目前，疫苗接種仍然是預防和控制該病普遍采用的方法。 NDV4是廣泛應用于東南亞和非洲等熱帶亞熱帶地區(qū)的一種耐熱疫苗株，具有耐熱性和免疫持續(xù)期長等優(yōu)點。NDV4-C株是V4疫苗株在SPF雞胚上連續(xù)傳代篩選獲得的一株耐熱無毒株，目前NDV4毒株的研究相對滯后，一個主要的原因是反向遺傳操作系統(tǒng)平臺尚未建立，相應的耐熱性和免疫原性研究也鮮有報道。為此，本研究以NDV4-C株為研究對象，在對NDV4-C株全基因組序列系統(tǒng)解析的基礎上，首次建立了分別以T7啟動子和CMV啟動子的NDV4-C株反向遺傳操作系統(tǒng)，拯救病毒rNDV4-C (T7)和rNDV4-C (CMV)的耐熱性和生物學特性均與親本毒株相似。同時，為了評估NDV4-C株作為載體的可行性，構建了表達增強型綠色熒光蛋白的重組新城疫病毒rNDV4-eGFP，其在SPF雞胚上生長特性與親本病毒相似，重組病毒能夠穩(wěn)定表達增強型綠色熒光蛋白至少15代，結果...

【文章頁數(shù)】：81 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 新城疫概況
        1.1.1 新城疫
        1.1.2 新城疫病毒的形態(tài)和基因組結構
        1.1.3 新城疫病毒的復制策略
        1.1.4 新城疫病毒的生物學特性
        1.1.5 新城疫病毒 NDV4 疫苗株概況
    1.2 反向遺傳操作系統(tǒng)
        1.2.1 新城疫病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)
        1.2.2 新城疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的基礎應用研究
    1.3 本研究的目的和意義
第二章 NDV4-C 耐熱無毒株反向遺傳操作系統(tǒng)的建立
    2.1 材料和方法
        2.1.1 病毒和細胞
        2.1.2 質粒、菌株和合成基因
        2.1.3 SPF 雞胚和 SPF 雞
        2.1.4 主要試劑和儀器
        2.1.5 引物設計與合成
        2.1.6 病毒的純化
        2.1.7 病毒 RNA 的提取、反轉錄和 RT-PCR
        2.1.8 PCR 產(chǎn)物的測序
        2.1.9 輔助質粒和微基因組質粒的構建
        2.1.10 以 pOLTV5 為載體的全長 cDNA 克隆的構建
        2.1.11 以 pCI-neo 為載體的全長 cDNA 克隆的構建
        2.1.12 微基因組系統(tǒng)的功能驗證
        2.1.13 病毒的拯救
        2.1.14 間接免疫熒光檢測拯救病毒
        2.1.15 拯救病毒的序列鑒定和酶切鑒定
        2.1.16 拯救病毒的特性及致病性實驗
        2.1.17 拯救病毒的生長動力學曲線
        2.1.18 拯救病毒的耐熱性測定
    2.2 結果
        2.2.1 NDV4-C 全長基因組序列的測序和擴增
        2.2.2 NDV4-C 基因組全長 cDNA 克隆和輔助質粒的構建
        2.2.3 微基因組系統(tǒng)的功能驗證
        2.2.4 拯救病毒的鑒定
        2.2.5 間接免疫熒光鑒定
        2.2.6 拯救病毒的致病性測定
        2.2.7 拯救病毒的生長動力學曲線
        2.2.8 拯救病毒的耐熱性測定
        2.2.9 核酸序列號
    2.3 討論
第三章 表達綠色熒光蛋白重組 NDV 的構建和生物學特性研究
    3.1 材料和方法
        3.1.1 病毒、質粒和細胞
        3.1.2 SPF 雞胚
        3.1.3 主要試劑和儀器
        3.1.4 引物設計與合成
        3.1.5 含有 eGFP 基因重組 NDV4-C 病毒全長 cDNA 克隆的構建
        3.1.6 重組病毒 rNDV4-eGFP 的拯救
        3.1.7 rNDV4-eGFP 的序列鑒定
        3.1.8 rNDV4-eGFP 感染細胞的熒光鑒定
        3.1.9 拯救病毒表達外源基因穩(wěn)定性的測定
        3.1.10 拯救病毒的生長動力學曲線
    3.2 結果
        3.2.1 含有 eGFP 基因的重組 NDV4-C 基因組全長 cDNA 克隆的構建
        3.2.2 重組病毒的拯救
        3.2.3 重組病毒表達外源基因穩(wěn)定性的鑒定
        3.2.4 重組病毒在雞胚上的生長特性
    3.3 討論
第四章 聚合酶蛋白對 NDV4-C 耐熱性的作用研究
    4.1 材料和方法
        4.1.1 病毒、質粒和細胞
        4.1.2 SPF 雞胚
        4.1.3 主要試劑和儀器
        4.1.4 引物設計與合成
        4.1.5 嵌合病毒全長基因組 cDNA 克隆的構建
        4.1.6 突變病毒和嵌合病毒的拯救
        4.1.7 拯救病毒毒力的測定
        4.1.8 病毒生長動力學曲線的測定
        4.1.9 病毒耐熱性的測定
        4.1.10 病毒微基因組質粒的構建
        4.1.11 聚合酶蛋白活性的測定
    4.2 結果
        4.2.1 重組嵌合病毒基因組全長 cDNA 克隆的構建
        4.2.2 親本病毒和重組病毒的拯救
        4.2.3 拯救病毒的毒力
        4.2.4 拯救病毒的生長動力學
        4.2.5 拯救病毒的耐熱性測定
        4.2.6 表達熒光素酶的微基因組質粒構建
        4.2.7 聚合酶活性測定
    4.3 討論
第五章 rNDV4-LL01(F/HN) 耐熱嵌合病毒株的構建和免疫評價
    5.1 材料和方法
        5.1.1 病毒、質粒和細胞
        5.1.2 SPF 雞胚和 SPF 雞
        5.1.3 主要試劑和儀器
        5.1.4 引物設計與合成
        5.1.5 嵌合病毒全長基因組 cDNA 克隆的構建
        5.1.6 突變病毒和嵌合病毒的拯救
        5.1.7 嵌合病毒毒力的測定
        5.1.8 病毒生長動力學曲線的測定
        5.1.9 病毒耐熱性的測定
        5.1.10 免疫攻毒試驗
        5.1.11 HI 抗體和 IgG 抗體的檢測
        5.1.12 間接 ELISA 測定 IgA 抗體水平
        5.1.13 SPF 雞的排毒情況
        5.1.14 數(shù)據(jù)處理和分析
    5.2 結果
        5.2.1 突變病毒和嵌合病毒的拯救和鑒定
        5.2.2 突變病毒和嵌合病毒的毒力測定
        5.2.3 突變病毒和嵌合病毒在 SPF 雞胚上的生長特性
        5.2.4 突變病毒和嵌合病毒的耐熱性
        5.2.5 交叉血凝抑制試驗 (cross-HI)測定免疫組的 HI 滴度
        5.2.6 免疫組 IgG 抗體水平的測定
        5.2.7 免疫組 IgA 抗體水平的測定
        5.2.8 不同免疫組的免疫保護力和排毒情況
        5.2.9 rNDV4-MuF/HNLL01 免疫組排毒量較 rNDV4-C 免疫組顯著降低
    5.3 討論
第六章 全文結論
參考文獻
附錄
致謝
作者簡歷



本文編號：3843462