原始生殖細(xì)胞是精子和卵子的祖細(xì)胞,具有分化成精原細(xì)胞或卵原細(xì)胞的潛能。原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cell,PGC)具有多能性,能分化為精原細(xì)胞或卵原細(xì)胞最終形成配子。通過對原始生殖細(xì)胞由淺入深的逐漸探索,其在動物遺傳領(lǐng)域和生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的價值越來越重要。研究原始生殖細(xì)胞有助于揭示生殖細(xì)胞發(fā)生發(fā)育過程中相關(guān)基因作用機制和表觀遺傳學(xué)修飾調(diào)控機制,為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物提供材料,也輔助指導(dǎo)生殖疾病的相關(guān)研究;然而,目前對原始生殖細(xì)胞的形成機制的研究尚不完全清楚,難以在體外誘導(dǎo)獲得大量的原始生殖細(xì)胞,阻礙了其在動物遺傳學(xué)和生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。近年來,隨著測序技術(shù)的發(fā)展人們對表觀遺傳學(xué)修飾有了更全面的認(rèn)識,其中l(wèi)ncRNA與雄性生殖方面的研究尤為受到關(guān)注。研究表明在雄性哺乳動物的睪丸組織中存在著大量特異性表達(dá)的lncRNA,其中多條lncRNA與精子發(fā)生緊密相關(guān),并且在雄性生殖細(xì)胞增殖、分化的過程中起到重要調(diào)控作用。由于PGC細(xì)胞是精子的祖細(xì)胞,所以推測lncRNA對PGC的形成和分化起關(guān)鍵調(diào)控作用。然而目前針對lncRNA與生殖過程相關(guān)的研究主要集中在哺乳動物或果蠅,斑馬魚等模式生...

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【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
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縮略詞表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 原始生殖細(xì)胞
        1.1 原始生殖細(xì)胞的生物學(xué)特性
        1.2 原始生殖細(xì)胞研究進(jìn)展
            1.2.1 多細(xì)胞因子參與調(diào)控原始生殖細(xì)胞形成
            1.2.2 多信號通路參與調(diào)控生殖細(xì)胞形成
            1.2.3 JAK/STAT信號通路調(diào)控生殖細(xì)胞形成
    2 lncRNA與雄性生殖細(xì)胞
        2.1 表觀遺傳與雄性生殖細(xì)胞
        2.2 lncRNA與精子發(fā)生
        2.3 lncRNA與精子成熟
        2.4 lncRNA在生物性腺和性染色體中的功能
    3 研究目的及意義
    4 參考文獻(xiàn)
第二章 lncRNA-CEPT8的鑒定及理化性質(zhì)分析
    1 材料與方法
        1.1 主要試劑及儀器
            1.1.1 材料
            1.1.2 主要儀器設(shè)備
        1.2 方法
            1.2.1 雞生殖嵴總RNA提取
            1.2.2 如皋黃雞生殖嵴cDNA庫的建立
            1.2.3 RACE實驗
            1.2.4 雞原始生殖細(xì)胞分離純化
            1.2.5 亞細(xì)胞定位
            1.2.6 原核融合表達(dá)載體構(gòu)建
            1.2.7 菌液蛋白提取
            1.2.8 Western Blot檢測蛋白表達(dá)
        1.3 統(tǒng)計分析
    2 結(jié)果
        2.1 lncRNA-CEPT8在不同組織和細(xì)胞中的表達(dá)差異
        2.2 lncRNA-CEPT8編碼能力鑒定
            2.2.1 lncRNA-CEPT8亞細(xì)胞定位
            2.2.2 lncRNA-CEPT8開放閱讀框預(yù)測
            2.2.3 lncRNA-CEPT8原核融合表達(dá)載體構(gòu)建
            2.2.4 Western Blot檢測lncRNA-CEPT8編碼小肽能力
    3 討論
    4 小結(jié)
    5 參考文獻(xiàn)
第三章 lncRNA-CEPT8調(diào)節(jié)雞PGC生成的生物學(xué)功能研究
    1 材料與方法
        1.1 主要試劑及儀器
            1.1.1 材料
            1.1.2 主要儀器設(shè)備
        1.2 方法
            1.2.1 lncRNA-CEPT8干擾靶位點選擇與干擾載體構(gòu)建
            1.2.2 lncRNA-CEPT8過量表達(dá)載體構(gòu)建
            1.2.3 干擾和過表達(dá)載體活性檢測
            1.2.4 雞胚體干細(xì)胞分離培養(yǎng)
            1.2.5 體內(nèi)研究lncRNA-CEPT8在PGC形成中的功能
            1.2.6 體外研究lncRNA-CEPT8在PGC形成中的功能
    2 結(jié)果
        2.1 lncRNA-CEPT8干擾與過表達(dá)載體構(gòu)建及活性檢測
        2.2 體內(nèi)研究檢測lncRNA-CEPT8在PGC形成中的功能
            2.2.1 qRT-PCR檢測不同lncRNA-CEPT8表達(dá)水平下PGC標(biāo)記基因表達(dá)變化
            2.2.2 流式細(xì)胞分析檢測PGC形成效率
            2.2.3 免疫組織化學(xué)染色觀察PGC形成效率
        2.3 體外研究lncRNA-CEPT8在PGC形成中的功能
            2.3.1 不同lncRNA-CEPT8表達(dá)水平下類PGC形成細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
            2.3.2 qRT-PCR檢測PGC標(biāo)記基因差異表達(dá)
            2.3.3 流式細(xì)胞分析檢測類PGC形成效率
            2.3.4 間接免疫熒光實驗觀察第四天CvhC-kit蛋白表達(dá)變化
    3 討論
    4 小結(jié)
    5 參考文獻(xiàn)
第四章 lncRNA-CEPT8調(diào)節(jié)靶基因Trim8表達(dá)影響雞原始生殖細(xì)胞形成機制初探
    1 材料與方法
        1.1 主要試劑及儀器
            1.1.1 材料
            1.1.2 主要儀器設(shè)備
        1.2 方法
            1.2.1 雞生殖嵴總RNA提取
            1.2.2 RT-PCR檢測不同lncRNA-CEPT8表達(dá)水平下Trim8基因表達(dá)變化
        1.3 Trim8干擾及過表達(dá)載體構(gòu)建
        1.4 干擾載體及過表達(dá)載體活性檢測
        1.5 體內(nèi)實驗研究Trim8在PGC形成中的功能
            1.5.1 雞胚血管注射
            1.5.2 流式細(xì)胞分析檢測PGC形成效率
            1.5.3 RT-PCR檢測PGC標(biāo)記基因表達(dá)變化
        1.6 體外實驗檢測驗證Trim8基因功能
            1.6.1 雞胚干細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)
            1.6.2 RT-PCR檢測PGC標(biāo)記基因表達(dá)水平
            1.6.3 流式細(xì)胞分析檢測PGC形成效率
        1.7 RT-PCR檢測STAT信號通路標(biāo)記基因STAT3和JAK2表達(dá)量
    2 結(jié)果
        2.1 RT-PCR檢測Trim8在lncRNA-CEPT8不同表達(dá)水平下基因表達(dá)量變化
        2.2 Trim8干擾與過表達(dá)載體構(gòu)建及活性檢測
        2.3 體內(nèi)研究檢測Trim8在PGC形成中的功能
            2.3.1 qRT-PCR檢測不同lncRNA-CEPT8表達(dá)水平下PGC標(biāo)記基因表達(dá)變化
            2.3.2 流式細(xì)胞分析檢測PGC形成效率
        2.4 體外研究lncRNA-CEPT8在PGC形成中的功能
            2.4.1 不同lncRNA-CEPT8表達(dá)水平下類PGC形成細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
            2.4.2 流式細(xì)胞分析檢測PGC形成效率
            2.4.3 qRT-PCR檢測不同lncRNA-CEPT8表達(dá)水平下PGC標(biāo)記基因表達(dá)變化
        2.5 RT-PCR檢測STAT信號通路標(biāo)記基因差異表達(dá)
    3 討論
    4 小結(jié)
    5 參考文獻(xiàn)
第五章 啟動子調(diào)控lncRNA-CEPT8表達(dá)影響初步探究
    1 材料和方法
        1.1 材料
        1.2 方法
            1.2.1 lncRNA-CEPT8啟動子區(qū)域生物信息學(xué)分析
            1.2.2 全基因組提取
            1.2.3 真核表達(dá)載體pEGFP-CEPT8及逐段截取各啟動子片段載體構(gòu)建
            1.2.4 lncRNA-CEPT8啟動子關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域鑒定
            1.2.5 啟動子關(guān)鍵正向調(diào)控區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測
            1.2.6 轉(zhuǎn)錄因子影響lncRNA-CEPT8表達(dá)水平
    2 結(jié)果
        2.1 真核表達(dá)載體pEGFP-CEPT8與啟動子逐段截取片段載體構(gòu)建
        2.2 lncRNA-CEPT8啟動子活性定性分析
        2.3 lncRNA-CEPT8啟動子關(guān)鍵正向調(diào)控區(qū)域確定及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測
        2.4 轉(zhuǎn)錄因子PAX2,PAX5及KLF4點突變載體構(gòu)建及活性檢測
        2.5 添加甲基化/乙酰化抑制劑對lncRNA-CEPT8啟動子區(qū)影響
    3 討論
    4 小結(jié)
    5 參考文獻(xiàn)
全文結(jié)論與創(chuàng)新
    全文結(jié)論
    全文創(chuàng)新點
    有待改進(jìn)之處
致謝
研究生期間發(fā)表的論文
附錄



本文編號：3840723