腫瘤壞死因子(TNF-α)是激活的單核-巨噬細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子,它具有廣泛的生物學(xué)活性,因此從發(fā)現(xiàn)至今一直是研究的重點。但是其生物學(xué)活性的兩面性,又使它在臨床應(yīng)用中有很大的限制,于是人們通過構(gòu)建其突變體的方法,以期增強(qiáng)其抗腫瘤活性并降低其毒副作用。本實驗就是在對人TNF-α研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。我們首先獲得了家豬TNF-α基因的CDS區(qū)全長,通過PCR的方法構(gòu)建得到了前7個氨基酸殘基缺失,8位Ser、9位Asp、156位Leu分別突變?yōu)長ys、Arg和Phe的TNF-α突變體基因(標(biāo)記為PmTNF-α)。分別構(gòu)建了野生型和突變型TNF-α原核表達(dá)載體,并得到了高純度的重組蛋白。用質(zhì)譜法分析了突變體重組蛋白的分子量為16.7kDα。CCK-8法和流式細(xì)胞術(shù)檢測了野生型和突變型TNF-α重組蛋白對L929細(xì)胞的細(xì)胞毒活性,證明突變型蛋白對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性明顯增強(qiáng)。我們又用酶標(biāo)法檢測了兩種重組蛋白刺激L02細(xì)胞分泌LDH的情況,證明了突變體蛋白的毒副作用有所降低。最后我們對兩種重組蛋白進(jìn)行了溶血性分析,突變型蛋白和野生型蛋白相比溶血性沒有明顯的增強(qiáng)。通過本實驗,我們構(gòu)建出了一種活性明顯...

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
第一部分 文獻(xiàn)綜述
    第1章 腫瘤壞死因子(TNF-α)研究進(jìn)展
        1.1 腫瘤壞死因子(TNF-α)的生理生化性質(zhì)
        1.2 腫瘤壞死因子(TNF-α)的表達(dá)分布
        1.3 腫瘤壞死因子(TNF-α)受體及其信號通路
            1.3.1 TNFR1信號通路
            1.3.2 TNFR2信號通路
        1.4 腫瘤壞死因子(TNF-α)的生物學(xué)功能
            1.4.1 細(xì)胞毒活性
            1.4.2 宿主防御功能
            1.4.3 惡液質(zhì)效應(yīng)
            1.4.4 激活內(nèi)皮細(xì)胞
            1.4.5 促使B細(xì)胞增殖及免疫球蛋白的產(chǎn)生
            1.4.6 T細(xì)胞胸腺細(xì)胞活化作用
            1.4.7 自然殺傷細(xì)胞的激活作用
            1.4.8 脂肪細(xì)胞的分化
            1.4.9 TNF-α與心臟疾病
            1.4.10 TNF-α在卵巢中的作用
        1.5 腫瘤壞死因子(TNF-α)抗腫瘤作用機(jī)制
            1.5.1 與受體結(jié)合誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡
            1.5.2 作用腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞,使腫瘤血管功能紊亂
            1.5.3 增強(qiáng)宿主的免疫功能
        1.6 結(jié)語與展望
    第2章 腫瘤壞死因子(TNF-α)突變體研究進(jìn)展
        2.1 TNF-α活性部位
        2.2 TNF-α突變體研究
        2.3 結(jié)語與展望
    第3章 中國家豬養(yǎng)殖現(xiàn)狀簡介
第二部分 實驗部分
    第4章 家豬TNF-α突變體基因的構(gòu)建、表達(dá)及活性鑒定
        4.1 實驗材料
            4.1.1 實驗動物、細(xì)胞、質(zhì)粒和宿主菌
            4.1.2 試劑和耗材
            4.1.3 實驗儀器
        4.2 實驗方法
            4.2.1 家豬TNF-α基因的克隆
            4.2.2 家豬TNF-α野生型表達(dá)基因及突變體表達(dá)基因的獲得
            4.2.3 重組表達(dá)載體pET28a-PmTNF-α及pET28α-PwTNF-α的構(gòu)建
            4.2.4 重組蛋白體外表達(dá)
            4.2.5 重組蛋白純化及Western blot鑒定
            4.2.6 質(zhì)譜分析重組突變體蛋白分子量
            4.2.7 抗腫瘤細(xì)胞活性鑒定
            4.2.8 酶標(biāo)法檢測TNF-α對L02細(xì)胞毒副作用
            4.2.9 溶血性分析
        4.3 實驗結(jié)果與分析
            4.3.1 家豬TNF-α基因獲得
            4.3.2 家豬TNF-α野生型表達(dá)基因及突變體表達(dá)基因的獲得
            4.3.3 重組表達(dá)載體pET28α-PmTNF-α及pET28a-PwTNF-α的構(gòu)建
            4.3.4 重組蛋白的表達(dá)與純化
            4.3.5 質(zhì)譜分析重組突變體蛋白分子量
            4.3.6 CCK-8法分析重組家豬TNF-α蛋白對L929細(xì)胞毒活性
            4.3.7 流式細(xì)胞技術(shù)分析重組家豬TNF-α蛋白對L929細(xì)胞毒活性
            4.3.8 酶標(biāo)法分析重組家豬TNF-α蛋白對L02細(xì)胞的毒副作用
            4.3.9 溶血性分析
        4.4 討論
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
附錄: 碩士在讀期間研究成果
致謝



本文編號：3832907