牛環(huán)形泰勒蟲病是由環(huán)形泰勒蟲（Theileria annulata）寄生于牛的紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞內(nèi)引起的以貧血、稽留熱為主要臨床癥狀的一種蜱傳血液性原蟲病。迄今為止，還沒(méi)有防治環(huán)形泰勒蟲病的特效藥物，由于新疆特殊的地理環(huán)境條件，媒介蜱分布廣而多，該病的發(fā)病率在我區(qū)呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響了養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。因此，在牛環(huán)形泰勒蟲病的防控工作中，在篩選病原表面抗原靶基因的基礎(chǔ)上，研發(fā)高靈敏度及高通量的檢測(cè)技術(shù)就顯得尤為重要。本研究進(jìn)行了如下三方面的研究工作： （�。┍狙芯浚鶕�(jù)GenBank中已發(fā)表的牛環(huán)形泰勒蟲Tams1基因序列，設(shè)計(jì)合成5對(duì)引物，采用基因工程技術(shù)分別擴(kuò)增Tams1基因的全長(zhǎng)基因（AE）、無(wú)N端及C端疏水區(qū)（BC）、僅缺乏N端疏水區(qū)（BE）片段，從而構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒。結(jié)果顯示：成功地?cái)U(kuò)增了Tams1基因的AE、BC、BE等片段，構(gòu)建了pGEX-4T-2-BE，pGEX-4T-2-BC，pGEX-4T-2-AE、pET-28a-BC，pET-28a-BE，pET-30a-BC，pET-30a-BE等7種原核表達(dá)重組質(zhì)粒；測(cè)序結(jié)果表明克隆的Tams1序列及推導(dǎo)氨基酸序...

【文章頁(yè)數(shù)】：73 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略詞表
第1章 環(huán)形泰勒蟲病的研究進(jìn)展
    1.1 環(huán)形泰勒蟲病的概況
        1.1.1 病原形態(tài)
        1.1.2 生活史
        1.1.3 免疫及生化指標(biāo)影響
        1.1.4 臨床癥狀及病理變化
        1.1.5 流行病學(xué)
        1.1.6 防治
    1.2 環(huán)形泰勒蟲病診斷方法研究進(jìn)展
        1.2.1 病原學(xué)診斷
        1.2.2 血清學(xué)診斷
        1.2.3 分子生物學(xué)診斷
    1.3 本課題研究的目的意義
第2章 環(huán)形泰勒蟲新疆株 Tams1 基因片段的克隆表達(dá)及篩選
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 樣品來(lái)源
        2.1.2 菌種及質(zhì)粒
        2.1.3 試劑及工具酶
        2.1.4 主要儀器設(shè)備
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 牛環(huán)形泰勒蟲新疆流行株的分離獲得
        2.2.2 環(huán)形泰勒蟲 Tams1 基因序列分析及引物設(shè)計(jì)
        2.2.3 全血基因組 DNA 的提取
        2.2.4 環(huán)形泰勒蟲 Tams1 基因的 PCR 擴(kuò)增
        2.2.5 PCR 產(chǎn)物的回收與純化
        2.2.6 重組表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.7 重組表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        2.2.8 重組表達(dá)質(zhì)粒的篩選與鑒定
        2.2.9 目的基因序列測(cè)定
        2.2.10 重組表達(dá)質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.2.11 高效可溶性表達(dá)重組質(zhì)粒的篩選
        2.2.12 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化
        2.2.13 目的蛋白的純化
        2.2.14 Western blotting 分析
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 牛環(huán)形泰勒蟲 Tams1 基因的擴(kuò)增
        2.3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定結(jié)果
        2.3.3 目的基因 Tams1 的測(cè)序分析結(jié)果
        2.3.4 高效可溶性表達(dá)重組質(zhì)粒的篩選
        2.3.5 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化結(jié)果
        2.3.6 目的蛋白的純化及鑒定
        2.3.7 目的蛋白的純化及鑒定
    2.4 討論與分析
        2.4.1 Tams1 基因亞克隆抗原位點(diǎn)的選擇及序列分析
        2.4.2 表達(dá)載體的選擇
        2.4.3 Western blotting 分析
    2.5 小結(jié)
第3章 牛環(huán)形泰勒蟲病間接 ELISA 檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用
    3.1 試驗(yàn)材料
        3.1.1 抗原及血清
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器設(shè)備
        3.1.4 臨床樣品來(lái)源
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 His-BE 蛋白的定量
        3.2.2 間接 ELISA 方法的建立
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 His-BE 蛋白濃度的測(cè)定
        3.3.2 最佳包被緩沖液的選擇結(jié)果
        3.3.3 最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的確定結(jié)果
        3.3.4 包被條件的確定結(jié)果
        3.3.5 最佳封閉液及封閉時(shí)間的確定
        3.3.6 血清最佳作用時(shí)間的確定
        3.3.7 酶標(biāo)二抗最佳工作濃度和時(shí)間的確定
        3.3.8 底物作用時(shí)間的確定
        3.3.9 陰陽(yáng)性臨界值的確定
        3.3.10 間接 ELISA 方法評(píng)測(cè)的結(jié)果
        3.3.11 樣品檢測(cè)結(jié)果
    3.4 討論與分析
        3.4.1 間接 ELISA 條件的優(yōu)化
        3.4.2 間接 ELISA 方法的特點(diǎn)
    3.5 小結(jié)
第4章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3831327