【目的】本研究利用雞朊蛋白過表達(dá)DF-1細(xì)胞系，與正常DF-1細(xì)胞在增殖、粘附、侵襲和凋亡方面的比較，初步探究禽朊蛋白對DF-1細(xì)胞的影響；通過檢測朊蛋白過表達(dá)DF-1細(xì)胞與正常DF-1細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Akt的表達(dá)量，并采用渥曼青霉素阻斷增殖相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（PI3K/Akt途徑），闡明朊蛋白過表達(dá)影響DF-1細(xì)胞的分子機(jī)制，進(jìn)一步了解禽朊蛋白的生理功能，為研究禽源細(xì)胞腫瘤發(fā)生提供理論依據(jù)。 【方法】（1）根據(jù)GenBank中雞Akt和β-actin基因序列各設(shè)計一對引物，經(jīng)過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立針對ChAkt mRNA的反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測方法；將DF-1-PrP、DF-1-cont和DF-1細(xì)胞提取總RNA，以該法進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，再進(jìn)行統(tǒng)計分析。（2）在DF-1-PrP、DF-1-cont和DF-1細(xì)胞中加入不同濃度渥曼青霉素，作用一段時間后，利用細(xì)胞MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、粘附實驗和侵襲實驗等方法檢測朊蛋白與Akt對DF-1細(xì)胞增殖、粘附、侵襲和凋亡的影響，并利用實驗室建立的PRNP SYBRGreenⅠ雙標(biāo)準(zhǔn)曲線熒光定量PCR檢測方法，檢測在不同渥曼青霉素濃度下朊蛋白的...

【文章頁數(shù)】：51 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Summary
縮寫詞英漢對照表
第一章 緒論
    1. 朊蛋白生理功能的研究進(jìn)展
        1.1 PrPC的生理功能
            1.1.1 PrPC神經(jīng)系統(tǒng)中的功能
            1.1.2 PrPC在免疫系統(tǒng)中的功能
            1.1.3 PrPC在細(xì)胞粘附中的作用
            1.1.4 PrPC和程序性細(xì)胞死亡
            1.1.5 PrPC促進(jìn)體內(nèi)神經(jīng)保護(hù)作用
                1.1.5.1 PrPC缺失小鼠
                1.1.5.2 PrPC轉(zhuǎn)基因小鼠
            1.1.6 PrPC促進(jìn)神體外經(jīng)保護(hù)作用
        1.2 PrPC和腫瘤耐受
            1.2.1 TNF 家族介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
            1.2.2 Bax 介導(dǎo)的細(xì)胞調(diào)亡
            1.2.3 紫杉醇介導(dǎo)的細(xì)胞調(diào)亡
        1.3 PrPC參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)
    2. PI3K/Akt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究進(jìn)展
        2.1 Akt 的生理功能
            2.1.1 Akt 結(jié)構(gòu)特征
            2.1.2 Akt 的調(diào)控
                2.1.2.1 依賴于 PI3K 的 Akt 活化
                2.1.2.2 不依賴于 PI3K 的 Akt 活化
            2.1.3 Akt 的功能
                2.1.3.1 直接調(diào)節(jié)細(xì)胞存活
                2.1.3.2 Akt 對細(xì)胞代謝的調(diào)控
                2.1.3.3 Akt 對細(xì)胞周期的調(diào)控
        2.2 PI3K 激酶抑制劑
    3. 研究目的及意義
    4.研究內(nèi)容和方法
        4.1 雞 Akt 基因 mRNA 定量 PCR 檢測方法的建立與評估
        4.2 渥曼青霉素對雞 DF-1 細(xì)胞與朊蛋白過表達(dá) DF-1 細(xì)胞增殖和凋亡的影響
第二章 雞 Akt 基因 mRNA 的 SYBR GreenⅠ實時定量 RT-PCR 檢測方法的建立
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 細(xì)胞與菌株
            1.1.2 主要試劑
            1.1.3 主要儀器
            1.1.4 引物的設(shè)計和合成
        1.2 方法
            1.2.1 RNA 的提取
            1.2.2 模板 cDNA 的合成和 PCR 擴(kuò)增
            1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建
            1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
            1.2.5 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗
            1.2.6 不同 DF-1 細(xì)胞 Akt 基因表達(dá)量的熒光定量 RT-PCR 檢測與數(shù)據(jù)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 電泳檢測 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物與陽性克隆的鑒定
        2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        2.3 不同 DF-1 細(xì)胞 Akt 基因的表達(dá)量
    3 討論
第三章 渥曼青霉素對雞DF-1細(xì)胞與朊蛋白過表達(dá)DF-1細(xì)胞增殖和凋亡的影響
    1 材料和方法
        1.1 材料
            1.1.1 細(xì)胞
            1.1.2 主要試劑
            1.1.3 主要儀器
        1.2 方法
            1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            1.2.2 粘附實驗
            1.2.3 侵襲實驗
            1.2.4 細(xì)胞增殖和凋亡檢測
                1.2.4.1 MTT 法檢測細(xì)胞增殖
                1.2.4.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡
            1.2.5 不同渥曼青霉素濃度下 PrPC的表達(dá)量檢測
    2 結(jié)果與分析
        2.1 渥曼青霉素以劑量依賴方式抑制 DF-1 細(xì)胞粘附
        2.2 渥曼青霉素以劑量依賴方式抑制 DF-1 細(xì)胞侵襲
        2.3 渥曼青霉素以劑量和時間依賴方式抑制 DF-1 細(xì)胞增殖
        2.4 渥曼青霉素以劑量依賴方式促進(jìn) DF-1 細(xì)胞凋亡
        2.5 不同渥曼青霉素濃度下 PrPC基因的表達(dá)差異分析
    3 討論
結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
作者簡介
導(dǎo)師簡介



本文編號：3830889