【目的】本研究利用雞朊蛋白過表達DF-1細胞系，與正常DF-1細胞在增殖、粘附、侵襲和凋亡方面的比較，初步探究禽朊蛋白對DF-1細胞的影響；通過檢測朊蛋白過表達DF-1細胞與正常DF-1細胞增殖相關蛋白Akt的表達量，并采用渥曼青霉素阻斷增殖相關信號轉導途徑（PI3K/Akt途徑），闡明朊蛋白過表達影響DF-1細胞的分子機制，進一步了解禽朊蛋白的生理功能，為研究禽源細胞腫瘤發(fā)生提供理論依據(jù)。 【方法】（1）根據(jù)GenBank中雞Akt和β-actin基因序列各設計一對引物，經(jīng)過優(yōu)化反應條件，建立針對ChAkt mRNA的反轉錄熒光定量PCR檢測方法；將DF-1-PrP、DF-1-cont和DF-1細胞提取總RNA，以該法進行熒光定量PCR擴增，再進行統(tǒng)計分析。（2）在DF-1-PrP、DF-1-cont和DF-1細胞中加入不同濃度渥曼青霉素，作用一段時間后，利用細胞MTT法、流式細胞術、粘附實驗和侵襲實驗等方法檢測朊蛋白與Akt對DF-1細胞增殖、粘附、侵襲和凋亡的影響，并利用實驗室建立的PRNP SYBRGreenⅠ雙標準曲線熒光定量PCR檢測方法，檢測在不同渥曼青霉素濃度下朊蛋白的...

【文章頁數(shù)】：51 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Summary
縮寫詞英漢對照表
第一章 緒論
    1. 朊蛋白生理功能的研究進展
        1.1 PrPC的生理功能
            1.1.1 PrPC神經(jīng)系統(tǒng)中的功能
            1.1.2 PrPC在免疫系統(tǒng)中的功能
            1.1.3 PrPC在細胞粘附中的作用
            1.1.4 PrPC和程序性細胞死亡
            1.1.5 PrPC促進體內(nèi)神經(jīng)保護作用
                1.1.5.1 PrPC缺失小鼠
                1.1.5.2 PrPC轉基因小鼠
            1.1.6 PrPC促進神體外經(jīng)保護作用
        1.2 PrPC和腫瘤耐受
            1.2.1 TNF 家族介導的細胞凋亡
            1.2.2 Bax 介導的細胞調(diào)亡
            1.2.3 紫杉醇介導的細胞調(diào)亡
        1.3 PrPC參與的信號轉導
    2. PI3K/Akt 信號轉導通路的研究進展
        2.1 Akt 的生理功能
            2.1.1 Akt 結構特征
            2.1.2 Akt 的調(diào)控
                2.1.2.1 依賴于 PI3K 的 Akt 活化
                2.1.2.2 不依賴于 PI3K 的 Akt 活化
            2.1.3 Akt 的功能
                2.1.3.1 直接調(diào)節(jié)細胞存活
                2.1.3.2 Akt 對細胞代謝的調(diào)控
                2.1.3.3 Akt 對細胞周期的調(diào)控
        2.2 PI3K 激酶抑制劑
    3. 研究目的及意義
    4.研究內(nèi)容和方法
        4.1 雞 Akt 基因 mRNA 定量 PCR 檢測方法的建立與評估
        4.2 渥曼青霉素對雞 DF-1 細胞與朊蛋白過表達 DF-1 細胞增殖和凋亡的影響
第二章 雞 Akt 基因 mRNA 的 SYBR GreenⅠ實時定量 RT-PCR 檢測方法的建立
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 細胞與菌株
            1.1.2 主要試劑
            1.1.3 主要儀器
            1.1.4 引物的設計和合成
        1.2 方法
            1.2.1 RNA 的提取
            1.2.2 模板 cDNA 的合成和 PCR 擴增
            1.2.3 標準質(zhì)粒的構建
            1.2.4 標準曲線的繪制
            1.2.5 重復性和穩(wěn)定性試驗
            1.2.6 不同 DF-1 細胞 Akt 基因表達量的熒光定量 RT-PCR 檢測與數(shù)據(jù)分析
    2 結果與分析
        2.1 電泳檢測 PCR 擴增產(chǎn)物與陽性克隆的鑒定
        2.2 標準曲線的建立
        2.3 不同 DF-1 細胞 Akt 基因的表達量
    3 討論
第三章 渥曼青霉素對雞DF-1細胞與朊蛋白過表達DF-1細胞增殖和凋亡的影響
    1 材料和方法
        1.1 材料
            1.1.1 細胞
            1.1.2 主要試劑
            1.1.3 主要儀器
        1.2 方法
            1.2.1 細胞培養(yǎng)
            1.2.2 粘附實驗
            1.2.3 侵襲實驗
            1.2.4 細胞增殖和凋亡檢測
                1.2.4.1 MTT 法檢測細胞增殖
                1.2.4.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡
            1.2.5 不同渥曼青霉素濃度下 PrPC的表達量檢測
    2 結果與分析
        2.1 渥曼青霉素以劑量依賴方式抑制 DF-1 細胞粘附
        2.2 渥曼青霉素以劑量依賴方式抑制 DF-1 細胞侵襲
        2.3 渥曼青霉素以劑量和時間依賴方式抑制 DF-1 細胞增殖
        2.4 渥曼青霉素以劑量依賴方式促進 DF-1 細胞凋亡
        2.5 不同渥曼青霉素濃度下 PrPC基因的表達差異分析
    3 討論
結論
致謝
參考文獻
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本文編號：3830889