狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的一種動(dòng)物源性人獸共患病,一旦感染出現(xiàn)臨床癥狀病死率為100%。犬冠狀病毒病是由犬冠狀病毒感染引起犬的一種接觸性傳染病,臨床上以嘔吐、腹瀉、脫水和血便為主要特征,致死率較低,但與其他傳染病如犬細(xì)小病毒、輪狀病毒等混合感染時(shí)死亡率明顯提高。本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了犬冠狀病毒N蛋白,免疫兔子后制備多克隆抗體,經(jīng)過ELISA、Western blotting等試驗(yàn)鑒定,表明所表達(dá)的蛋白具有良好的反應(yīng)原性和免疫原性,所制備的多克隆抗體具有良好的反應(yīng)特異性。本論文主要基于狂犬病病毒反向遺傳操作系統(tǒng)研制狂犬病和犬冠狀病毒病二聯(lián)基因工程疫苗。以狂犬病病毒弱毒SAD毒株為骨架,分別在狂犬病毒的N、P基因之間插入犬冠狀病毒N和S基因,構(gòu)建狂犬病毒全長cDNA,然后與輔助質(zhì)粒按一定的比例共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞拯救重組病毒,通過免疫熒光和qPCR試驗(yàn)篩選出含有目的基因的重組狂犬病病毒BNSP-CCV-N和BNSP-CCV-S,然后對(duì)重組病毒的生物學(xué)特性進(jìn)行了鑒定,Western blotting試驗(yàn)和免疫熒光試驗(yàn)表明重組病毒BNSP-CCV-N可同時(shí)表達(dá)RV-G蛋白和CCV-...

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 狂犬病概述
        1.1.1 狂犬病
        1.1.2 狂犬病流行病學(xué)
        1.1.3 狂犬病臨床癥狀與致病機(jī)理
        1.1.4 狂犬病毒基因組結(jié)構(gòu)和編碼蛋白
        1.1.5 狂犬疫苗研究進(jìn)展
    1.2 犬冠狀病毒病概述
        1.2.1 冠狀病毒概述
        1.2.2 犬冠狀病毒的臨床癥狀與致病機(jī)理
        1.2.3 犬冠狀病毒基因組結(jié)構(gòu)和編碼蛋白
        1.2.4 冠狀病毒疫苗研究進(jìn)展
    1.3 RNA病毒的反向遺傳操作和應(yīng)用
        1.3.1 正鏈RNA病毒的反向遺傳操作技術(shù)
        1.3.2 負(fù)鏈RNA病毒的反向遺傳操作技術(shù)
第二章 犬冠狀病毒N基因的原核表達(dá)及多克隆抗體制備
    2.1 材料與方法
        2.1.1 主要試劑
        2.1.2 N基因密碼子優(yōu)化及其重組表達(dá)質(zhì)粒p ET-B2M-N的構(gòu)建
        2.1.3 CCVN蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.1.4 免疫動(dòng)物
        2.1.5 血清抗體效價(jià)的ELISA測(cè)定
        2.1.6 抗體純化
        2.1.7 Western blotting檢測(cè)
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 重組質(zhì)粒的成功構(gòu)建
        2.2.2 重組N蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.2.3 多克隆抗體ELISA效價(jià)
        2.2.4 抗體純化結(jié)果
        2.2.5 Western blotting檢測(cè)結(jié)果
    2.3 討論
第三章 重組狂犬病病毒BNSP-CCV-N的拯救及生物學(xué)特性研究
    3.1 材料與方法
        3.1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞、病毒
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成
        3.1.4 PCR擴(kuò)增犬冠狀病毒N基因
        3.1.5 含犬冠狀病毒N基因的重組狂犬病病毒基因組全長cDNA克隆的構(gòu)建
        3.1.6 重組病毒的拯救
        3.1.7 免疫熒光鑒定重組病毒
        3.1.8 實(shí)時(shí)熒光定量qPCR試驗(yàn)
        3.1.9 重組病毒的傳代和外源基因穩(wěn)定性檢測(cè)
        3.1.10 重組病毒毒價(jià)測(cè)定以及生長曲線的測(cè)定
        3.1.11 重組病毒濃縮、純化
        3.1.12 Western blotting鑒定外源蛋白表達(dá)
        3.1.13 激光共聚焦觀察和電鏡觀察
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 犬冠狀病毒N基因的擴(kuò)增結(jié)果
        3.2.2 全長cDNA構(gòu)建結(jié)果
        3.2.3 qPCR鑒定重組病毒結(jié)果
        3.2.4 免疫熒光鑒定重組病毒結(jié)果
        3.2.5 重組病毒生長曲線的測(cè)定結(jié)果
        3.2.6 重組病毒的電鏡觀察結(jié)果
        3.2.7 Western Blotting鑒定外源蛋白的表達(dá)結(jié)果
        3.2.8 外源基因穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果
    3.3 討論
第四章 重組狂犬病病毒BNSP-CCV-S的拯救及生物學(xué)特性研究
    4.1 材料與方法
        4.1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞、病毒
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成
        4.1.4 PCR擴(kuò)增犬冠狀病毒S1、S2、S3 基因
        4.1.5 含犬冠狀病毒S1、S2、S3 基因的重組狂犬病病毒基因組全長c DNA克隆的構(gòu)建
        4.1.6 重組病毒的拯救
        4.1.7 免疫熒光鑒定重組病毒
        4.1.8 實(shí)時(shí)熒光定量qPCR試驗(yàn)
        4.1.9 重組病毒的傳代和外源基因穩(wěn)定性檢測(cè)
        4.1.10 重組病毒毒價(jià)測(cè)定以及生長曲線的測(cè)定
        4.1.11 Western blotting鑒定外源蛋白表達(dá)
        4.1.12 重組病毒濃縮、純化
        4.1.13 激光共聚焦觀察和電鏡觀察
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 犬冠狀病毒S1、S2、S3基因的擴(kuò)增結(jié)果
        4.2.2 全長cDNA構(gòu)建結(jié)果
        4.2.3 qPCR鑒定重組病毒結(jié)果
        4.2.4 免疫熒光鑒定重組病毒結(jié)果
        4.2.5 重組病毒生長曲線的測(cè)定結(jié)果
        4.2.6 BNSP-CCV-S重組病毒的電鏡觀察結(jié)果
        4.2.7 Western Blotting鑒定外源蛋白的表達(dá)結(jié)果
        4.2.8 外源基因穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果
    4.3 討論
第五章 重組病毒對(duì)小鼠的致病性及免疫效果評(píng)價(jià)
    5.1 材料與方法
        5.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、病毒
        5.1.2 主要試劑
        5.1.3 重組病毒對(duì)小鼠的致病性研究
        5.1.4 疫苗的制備與免疫試驗(yàn)
        5.1.5 RFFIT檢測(cè)狂犬病毒的中和抗體
        5.1.6 間接ELISA方法檢測(cè)N、S抗體
    5.2 結(jié)果
        5.2.1 重組病毒對(duì)小鼠致病性結(jié)果
        5.2.2 RFFIT檢測(cè)狂犬病毒的中和抗體結(jié)果
        5.2.3 間接ELISA檢測(cè)犬冠狀病毒特異性抗體結(jié)果
    5.3 討論
第六章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡歷



本文編號(hào)：3828917