動物性腺的分化和發(fā)育一直是人們研究的熱點,對生物學(xué)基礎(chǔ)研究和繁殖疾病的治療等方面有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物性別開關(guān)基因SRY,而禽類的性別決定和性腺發(fā)育調(diào)控機制還不清楚。本實驗室篩選出早期雞胚性腺發(fā)育過程中雌、雄個體差異表達基因CDK2AP1,在小鼠中的研究發(fā)現(xiàn)它對性腺的發(fā)育起著重要作用。本研究利用超表達和RNAi干涉技術(shù),在DF-1細胞中研究該基因與雞胚性腺發(fā)育生長相關(guān)基因間的調(diào)控關(guān)系,初步確定它在雞胚性腺發(fā)育中的功能。研究結(jié)果如下： 1. WISH檢測CDK2AP1在3.5d (St22)和4.5d (St25)雞胚以及5.5d (St28)和6.5d(St30)泌尿生殖系統(tǒng)中的表達,結(jié)果顯示該基因在3.5d(St22)和4.5d(St25)胚胎多種組織中均有表達,頭部和四肢尤為明顯,且雌、雄雞胚差異顯著。它在5.5d(St28)雌、雄性腺中表達差異不明顯,6.5d(St30)雌性性腺中表達量高于雄性；在5.5d(St28)雌、雄性腺中表達范圍和強度大于6.5d(St30)。 2.構(gòu)建了CDK2AP1超表達載體RC ASBP.B-CDK2AP1-GFP和三個CDK2AP1干涉載體...

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
目錄
摘要
Abstract
縮略詞表
1 前言
    1.1 研究背景
    1.2 CDK2AP1研究進展
        1.2.1 CDK2AP1基因
        1.2.2 CDK2AP1功能與作用機制
    1.3 研究目的與意義
2 材料與方法
    2.1 試驗材料
        2.1.1 試驗雞胚
        2.1.2 細胞系和質(zhì)粒
        2.1.3 主要試劑及試劑盒
        2.1.4 主要溶液配制
        2.1.5 主要儀器和設(shè)備
    2.2 試驗方法
        2.2.1 CDK2AP1正反義mRNA探針合成
        2.2.2 WISH
        2.2.3 CDK2AP1超表達載體構(gòu)建
        2.2.4 CDK2AP1干涉載體構(gòu)建
        2.2.5 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CDK2AP1超表達和干涉載體
        2.2.6 qPCR檢測mRNA水平超表達和干涉效果
        2.2.7 Western blot檢測蛋白水平超表達和干涉效果
        2.2.8 流式細胞儀檢測細胞周期
3 結(jié)果
    3.1 pGEM-T-CDK2AP1載體的鑒定
    3.2 斑點雜交檢測正反義探針效率
    3.3 CDK2AP1在雞胚和性腺中的表達
        3.3.1 CDK2AP1克隆載體的構(gòu)建
            3.3.1.1 CDK2AP1的擴增
            3.3.1.2 酶切和測序鑒定
        3.3.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒超表達載體構(gòu)建
            3.3.2.1 pSlax-13-CDK2AP1-GFP重組載體構(gòu)建
            3.3.2.2 CDK2APl超表達載體構(gòu)建
        3.3.3 CDK2AP1RNAi干涉載體構(gòu)建
            3.3.3.1 U6-shRNA擴增
            3.3.3.2 U6-shRNA克隆載體構(gòu)建
            3.3.3.3 pSlax-13-GFP-U6-shRNA重組載體的構(gòu)建
            3.3.3.4 RCASBP.B-GFP-U6-shRNA重組載體的構(gòu)建
        3.3.4 CDK2AP1超表達載體和RNAi載體轉(zhuǎn)染
    3.5 CDK2AP1超表達和RNAi效果檢測
        3.5.1 qPCR檢測CDK2AP1表達情況
        3.5.2 WB檢測CDK2AP1表達情況
    3.6 檢測CDK2AP1與雞胚性腺發(fā)育相關(guān)基因調(diào)控關(guān)系
        3.6.1 qPCR檢測ER、CDK2和TWIST2表達變化
        3.6.2 qPCR和WB檢測AR表達變化
        3.6.3 qPCR和WB檢測FOXO3a表達變化
    3.7 CDK2AP1對細胞周期的影響
4 討論
    4.1 CDK2AP1在早期雞胚中的表達
    4.2 CDK2AP1在雞胚泌尿生殖系統(tǒng)中的表達
    4.3 CDK2AP1與AR的調(diào)控關(guān)系
    4.4 CDK2AP1與FOXO3a和ERα的調(diào)控關(guān)系
    4.5 CDK2AP1與CDK2和TWIST2的調(diào)控關(guān)系
    4.6 CDK2AP1在雞胚及性腺發(fā)育中的作用
5 小結(jié)
    5.1 本研究所取得的結(jié)果
    5.2 下一步需要研究的問題
參考文獻
致謝



本文編號：3824896