哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin,m TOR)能夠調(diào)節(jié)細胞的生長。m TOR能夠組成兩種功能復(fù)合物:m TORC1和m TORC2,其中m TORC1能夠通過其上游多種“感受器”感受細胞內(nèi)外的一系列信號變化,包括能量狀態(tài)、生長因子和激素、營養(yǎng)因子等,來調(diào)節(jié)細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成和降解,從而調(diào)控細胞生長。營養(yǎng)因子中,氨基酸既是蛋白質(zhì)合成的必需底物,也是m TORC1活性調(diào)節(jié)的必要的信號分子。在氨基酸中,亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸被認為能有效調(diào)節(jié)m TORC1活性。且氨基酸轉(zhuǎn)運感受體參與氨基酸依賴性的m TOR活性調(diào)節(jié)過程。近幾年研究發(fā)現(xiàn)一種G蛋白偶聯(lián)受體T1R1/T1R3(Taste Receptor Type 1subtype1/3,T1R1/T1R3)能夠作為廣譜性的氨基酸感受體感應(yīng)胞外氨基酸,通過促進胞內(nèi)Ca2+增加激活ERK1/2來參與調(diào)控m TOR。然而目前研究主要針對胞外總的氨基酸,究竟哪些氨基酸參與該過程并不清楚,因此T1R1/T1R3介導(dǎo)調(diào)控m TOR信號是否具有氨基酸特異性及其調(diào)控機制有待進一步闡明。本課題研究內(nèi)容由兩部分組成,...

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語表
第一章 文獻綜述
    1 前言
    2. mTOR信號調(diào)控蛋白質(zhì)沉積
        2.1 mTORC1 定義及組成
        2.2 mTORC1 和蛋白質(zhì)合成
        2.3 mTORC1 與自噬和蛋白質(zhì)降解
    3 氨基酸對mTOR信號的調(diào)節(jié)
        3.1 調(diào)節(jié)mTOR信號的氨基酸
        3.2 氨基酸調(diào)節(jié)mTOR信號的機制
        3.3 不同種類氨基酸調(diào)節(jié)mTOR信號的區(qū)別
    4 mTOR信號調(diào)節(jié)中的氨基酸轉(zhuǎn)運感應(yīng)機制
        4.1 參與mTOR信號調(diào)節(jié)的氨基酸轉(zhuǎn)運體
        4.2 參與mTOR信號調(diào)節(jié)的氨基酸轉(zhuǎn)運感受體
        4.3 參與mTOR信號調(diào)節(jié)的氨基酸受體
    5 氨基酸受體T1R1/T1R3 在mTOR信號調(diào)節(jié)中的作用及機制
        5.1 T1R1/T1R3 定義及作用方式
        5.2 T1R1/T1R3 對氨基酸的感應(yīng)情況
        5.3 T1R1/T1R3 感應(yīng)氨基酸的種屬特異性
        5.4 T1R1/T1R3 發(fā)揮不同功能時的氨基酸特異性
        5.5 T1R1/T1R3 介導(dǎo)氨基酸調(diào)控mTOR信號的分子機制
        5.6 T1R1/T1R3 介導(dǎo)氨基酸調(diào)控mTOR信號的特異性
    6 問題的提出及研究的目的與意義
第二章 參與T1R1/T1R3 介導(dǎo)的調(diào)控mTOR信號的胞外氨基酸篩選
    1 前言
    2 實驗材料和方法
        2.1 實驗材料
        2.2 主要儀器、試劑和溶液的配制
            2.2.1 主要儀器
            2.2.2 主要試劑和試劑盒
            2.2.3 主要溶液的配制
        2.3 實驗方法
            2.3.1 C2C12 細胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化
            2.3.2 細胞藥物處理
            2.3.3 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄
            2.3.4 Q-PCR
            2.3.5 細胞總蛋白抽提及Western blot檢測
            2.3.6 SUnSET非放射性方法測蛋白質(zhì)合成速率
            2.3.7 Fluo-8 檢測胞內(nèi)Ca2+變化
            2.3.8 統(tǒng)計分析
    3 結(jié)果與分析
        3.1 Q-PCR鑒定C2C12 成肌細胞中T1R1/T1R3 的表達情況
        3.2 C2C12 細胞中T1R1/T1R3 感應(yīng)氨基酸的功能驗證
            3.2.1 [Ca2+] i抑制劑BAPTA-AM處理對mTORC1 的影響
            3.2.2 ERK1/2 抑制劑U0126 處理對mTORC1 的影響
            3.2.3 T1R1/T1R3 感應(yīng)氨基酸增強劑處理對mTORC1 的影響
        3.3 影響T1R1/T1R3、mTOR信號的氨基酸篩選
            3.3.1 Western blot驗證能影響細胞內(nèi)Ca2+濃度的氨基酸mTORC1 的影響
            3.3.2 SUnSET非放射性方法檢測蛋氨酸對蛋白質(zhì)合成的影響
            3.3.3 Rapamycin處理對蛋氨酸誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成的影響
            3.3.4 Q-PCR檢測蛋氨酸對蛋白質(zhì)降解相關(guān)基因Atrogin1 及MuRF1 水平的影響
    4 討論
        4.1 T1R1/T1R3 在C2C12 細胞中的表達及功能驗證
        4.2 影響 T1R1/T1R3、m TOR 信號的氨基酸篩選
第三章 C2C12 成肌細胞內(nèi)氨基酸調(diào)控mTORC1 的機制及特異性研究
    1 前言
    2 實驗材料和方法
        2.1 實驗材料
        2.2 試驗方法
    3 結(jié)果與分析
        3.1 蛋氨酸調(diào)控 m TORC1 的機制
            3.1.1 IMP處理對蛋氨酸引起的蛋白質(zhì)合成相關(guān)蛋白水平的影響
            3.1.2 U73122 處理對蛋氨酸引起的蛋白質(zhì)合成的影響
            3.1.3 蛋氨酸對細胞內(nèi) Ca²⁺的影響
            3.1.4 BAPTA-AM處理對蛋氨酸誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成的影響
            3.1.5 U0126 處理對蛋氨酸誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成的影響
        3.2 ERK1/2 在T1R1/T1R3 介導(dǎo)蛋氨酸調(diào)控mTOR中的作用
        3.3 T1R1/T1R3 介導(dǎo)調(diào)控mTOR信號的氨基酸特異性研究
            3.3.1 不同氨基酸處理對p-ERK、p-mTOR蛋白水平的影響
            3.3.2 BAPTA-AM、U0126 處理對亮氨酸誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成的影響
            3.3.3 蛋氨酸、亮氨酸處理對蛋白質(zhì)合成相關(guān)蛋白水平的影響比較
            3.3.4 蛋氨酸調(diào)控mTOR的種屬特異性
    4 討論
        4.1 蛋氨酸能通過T1R1/T1R3-PLC-Ca²⁺-ERK1/2 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活mTORC1。
        4.2 ERK1/2 在 T1R1/T1R3 介導(dǎo)蛋氨酸調(diào)控 m TOR 中的作用。
        4.3 T1R1/T1R3 介導(dǎo)氨基酸調(diào)控mTOR信號具有氨基酸特異性。
        4.4 小結(jié)
結(jié)語
    1 研究結(jié)論
    2 創(chuàng)新點
    3 本研究不足之處
參考文獻
致謝



本文編號：3821744