豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea, PED)是豬的一種高度接觸性傳染病。1978年該病病原豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)得到了首次鑒定。自2010年下半年以來,該病在我國的流行強(qiáng)度不斷擴(kuò)大,還伴有哺乳仔豬高死亡率等特點(diǎn),給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前,國內(nèi)外還沒有建立一種標(biāo)準(zhǔn)化的,能在基層推廣使用的PEDV鑒別檢測(cè)方法。對(duì)國內(nèi)流行毒株進(jìn)行進(jìn)一步的流行病學(xué)調(diào)查,并建立一種快速,準(zhǔn)確的鑒別診斷方法是了解我國PED流行狀況,更好的防控該病的前提,具有重要的實(shí)踐意義。本研究具體內(nèi)容如下： 1豬流行性腹瀉病毒RT-PCR檢測(cè)方法的建立與流行病學(xué)調(diào)查 針對(duì)PEDV的保守基因M建立了RT-PCR檢測(cè)方法,并證實(shí)其具有較高的敏感性和特異性。用建立的RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)豬群中的PEDV流行情況進(jìn)行了調(diào)查,2011年3月至2012年12月間從9個(gè)省市共24個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)采集的113份腹瀉病料的檢測(cè)結(jié)果顯示,有20個(gè)豬場(chǎng)70份樣品為PEDV陽性,豬場(chǎng)陽性率達(dá)到83.33%,樣品陽性率為61.95%,說明P...

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
目錄
摘要
ABSTRACT
第一篇 文獻(xiàn)綜述
    1 PED簡(jiǎn)介
    2 PEDV概述
        2.1 PEDV粒子結(jié)構(gòu)
        2.2 PEDV理化與培養(yǎng)特性
        2.3 PEDV生物學(xué)分類地位
    3 PED流行特點(diǎn)和流行情況
    4 PED發(fā)病機(jī)理
    5 PED診斷技術(shù)
    6 PED的防治
    參考文獻(xiàn)
第二篇 研究內(nèi)容
    第一章 豬流行性腹瀉病毒RT-PCR檢測(cè)方法的建立與流行病學(xué)調(diào)查
        摘要
        1 材料
            1.1 毒株及被檢樣本
            1.2 主要儀器設(shè)備
            1.3 主要試劑
        2 方法
            2.1 引物設(shè)計(jì)
            2.2 病毒RNA的提取
            2.3 反轉(zhuǎn)錄制備cDNA
            2.4 PCR條件的優(yōu)化
            2.5 敏感性實(shí)驗(yàn)
            2.6 特異性實(shí)驗(yàn)
            2.7 病料的采集與RT-PCR方法的臨床應(yīng)用
        3 結(jié)果
            3.1 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化及反應(yīng)體系的確定
            3.2 敏感性試驗(yàn)
            3.3 特異性試驗(yàn)
            3.4 病料RT-PCR檢測(cè)結(jié)果
        4 討論
        參考文獻(xiàn)
        ABSTRACT
    第二章 PEDV部分S蛋白的原核表達(dá)
        摘要
        1 材料
            1.1 載體與菌種
            1.2 病毒、細(xì)胞與參考血清
            1.3 主要試劑
            1.4 主要儀器
        2 方法
            2.1 引物合成
            2.2 RT-PCR擴(kuò)增目的片段
            2.3 PCR產(chǎn)物回收純化
            2.4 PCR產(chǎn)物與原核表達(dá)載體的酶切處理
            2.5 酶切產(chǎn)物的回收和純化
            2.6 目的基因與表達(dá)載體的連接
            2.7 重組質(zhì)粒的鑒定
            2.8 重組蛋白的表達(dá)和鑒定
            2.9 重組蛋白穩(wěn)定性分析
            2.10 重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化
            2.11 重組蛋白溶解性的判定
            2.12 重組蛋白的大量誘導(dǎo)和純化
        3 結(jié)果
            3.1 S582基因的PCR擴(kuò)增
            3.2 重組質(zhì)粒的鑒定
            3.3 重組質(zhì)粒的測(cè)序
            3.4 重組蛋白S582的SDS-PAGE鑒定
            3.5 Western blot鑒定重組蛋白反應(yīng)原性
            3.6 重組蛋白穩(wěn)定性和反應(yīng)原性分析
            3.7 重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化
            3.8 重組蛋白溶解性的判定
            3.9 重組蛋白的親和純化
            3.10 復(fù)性重組蛋白的抗原性分析
            3.11 不同批次重組蛋白質(zhì)量檢測(cè)
        4 討論
        參考文獻(xiàn)
        ABSTRACT
    第三章 PEDV間接ELISA檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用
        摘要
        1 材料
        2 方法
            2.1 抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定
            2.2 抗原包被時(shí)間的選擇
            2.3 封閉劑的選擇
            2.4 封閉時(shí)間的確定
            2.5 一抗最佳反應(yīng)時(shí)間的確定
            2.6 二抗最佳稀釋倍數(shù)及反應(yīng)時(shí)間的確定
            2.7 底物最佳反應(yīng)時(shí)間的確定
            2.8 陰陽性臨界值的確定
            2.9 特異性分析
            2.10 敏感性分析
            2.11 符合率分析
            2.12 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)
            2.13 臨床應(yīng)用
        3 結(jié)果
            3.1 抗原最佳包被濃度及待檢血清最佳稀釋度的選擇
            3.2 抗原最佳包被時(shí)間
            3.3 封閉液的選擇
            3.4 封閉時(shí)間的確定
            3.5 一抗作用時(shí)間確定
            3.6 酶標(biāo)二抗作用濃度和時(shí)間的確定
            3.7 底物最佳反應(yīng)時(shí)間的確定
            3.8 陰陽性臨界值的確定
            3.9 特異性分析
            3.10 敏感性分析
            3.11 符合率分析
            3.12 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)
        4 討論
        參考文獻(xiàn)
        ABSTRACT
全文總結(jié)
致謝



本文編號(hào)：3817027