水牛具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐高溫高濕、抗病力強(qiáng)、耐粗飼、容易飼養(yǎng)、使用年限長等優(yōu)點(diǎn),非常適合我國南方農(nóng)村飼養(yǎng),是我國南方極具開發(fā)價值的大家畜�？谔阋呤且环N由口蹄疫病毒引起的以侵害偶蹄動物為主的急性、熱性、高度接觸性傳染病,被世界動物衛(wèi)生組織列為A類動物傳染病。為應(yīng)用水牛RNA聚合酶Ⅲ啟動子進(jìn)行基因沉默研究,探討應(yīng)用RNAi沉默水�？谔阋卟《镜目尚行�,本研究對水牛的7SK和U6啟動子進(jìn)行了克隆與活性分析,并應(yīng)用其構(gòu)建了多啟動子串聯(lián)RNAi抗口蹄疫病毒轉(zhuǎn)基因小鼠模型,取得了如下的研究結(jié)果： 1、水牛7SK和U6啟動子克隆與功能分析。參考牛的基因組序列,設(shè)計特異性擴(kuò)增引物,成功克隆了長430bp和357bp的水牛7SK (Genbank序列號：JN417658)和U6啟動子(Genbank序列號：JN417659)。為對比不同物種polⅢ啟動子的活性,本研究還克隆了人、豬和牛的7SK和U6啟動子�？寺〉膯幼优c針對EGFP的短發(fā)卡RNA (shRNA)雙鏈DNA片段(shEGFP)相連接,成功構(gòu)建8個EGFP沉默表達(dá)載體(pbu7SK-shEGFP、 pbuU6-shEGFP、ph7SK-shEGF...

【文章頁數(shù)】：135 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 RNAI技術(shù)的機(jī)制與應(yīng)用
        1.1.1 RNA干擾現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)
        1.1.2 RNAi技術(shù)的基本分子機(jī)制
        1.1.3 RNAi應(yīng)用
    1.2 RNA聚合酶Ⅲ啟動子的結(jié)構(gòu)和應(yīng)用
        1.2.1 RNA聚合酶Ⅲ啟動子的起源
        1.2.2 RNA聚合酶Ⅲ啟動子的結(jié)構(gòu)
        1.2.3 RNA聚合酶Ⅲ啟動子的可修飾性
        1.2.4 各物種RNA聚合酶Ⅲ啟動子的克隆與鑒定
    1.3 RNAI技術(shù)抗病毒原理和應(yīng)用
        1.3.1 RNAi技術(shù)抗病毒基本原理
        1.3.2 RNAi技術(shù)抗病毒應(yīng)用
    1.4 口蹄疫的概述
        1.4.1 口蹄疫的發(fā)生和危害
        1.4.2 流行病學(xué)特點(diǎn)及臨床診斷
        1.4.3 防治手段
        1.4.4 口蹄疫病毒基本結(jié)構(gòu)
        1.4.5 口蹄疫病毒的致病機(jī)制
    1.5 動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究進(jìn)展和意義
        1.5.1 動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用
        1.5.2 動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用
    1.6 研究目的及意義
第二章 水牛RNA聚合酶Ⅲ啟動子的克隆及鑒定
    摘要
    前言
    2.1 材料與試劑
    2.2 主要試驗儀器
    2.3 試驗方法
        2.3.1 全基因組DNA的抽提
        2.3.2 水牛啟動子擴(kuò)增及測序
        2.3.3 降落PCR
        2.3.4 RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.3.5 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
        2.3.6 總RNA的抽提
        2.3.7 shEGFP表達(dá)量的莖-環(huán)RT-PCR對分析
        2.3.8 細(xì)胞表達(dá)EGFP的流式細(xì)胞儀的分析
        2.3.9 細(xì)胞表達(dá)EGFP的熒光實時定量PCR分析
    2.4 結(jié)果
        2.4.1 水牛7SK、U6啟動子的克隆
        2.4.2 7SK和U6啟動子表達(dá)shRNA載體的構(gòu)建
        2.4.3 shEGFP表達(dá)量的實時定量PCR檢測
        2.4.4 啟動子在細(xì)胞中引導(dǎo)表達(dá)shRNA的效果
        2.4.5 EGFP表達(dá)的熒光實時定量PCR結(jié)果
    2.5 討論
    2.6 結(jié)論
第三章 多SHRNA串聯(lián)表達(dá)抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建與功能性檢測
    摘要
    前言
    3.1 材料與試劑
    3.2 主要試驗儀器
    3.3 試驗方法
        3.3.1 抗口蹄疫shRNA選擇和合成
        3.3.2 多shRNA串聯(lián)抗口蹄疫表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.3.3 多個shRNA串聯(lián)抗口蹄疫表達(dá)載體的慢病毒包裝
        3.3.4 慢病毒載體的滴度測定
        3.3.5 轉(zhuǎn)基因BHK-LV細(xì)胞制備
        3.3.6 shRNA表達(dá)量的實時定量PCR測定
        3.3.7 FMDV在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞BHK-LV中的復(fù)制曲線繪制
        3.3.8 抗口蹄疫慢病毒載體的乳鼠FMDV抗性試驗
    3.4 結(jié)果
        3.4.1 選擇和設(shè)計的抗口蹄疫shRNA序列
        3.4.2 構(gòu)建得到的多個shRNA串聯(lián)抗口蹄疫慢病毒表達(dá)載體和制備的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞
        3.4.3 FMDV在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制情況
        3.4.4 慢病毒LV-3shRNA處理乳鼠的抗FMDV能力
    3.5 討論
    3.6 結(jié)論
第四章 抗口蹄疫RNAI轉(zhuǎn)基因小鼠模型構(gòu)建和抗病毒水平檢測
    摘要
    前言
    4.1 材料與試劑
    4.2 主要試驗儀器
    4.3 試驗方法
        4.3.1 轉(zhuǎn)基因用目的DNA制備
        4.3.2 轉(zhuǎn)基因小鼠制備
        4.3.3 鼠尾基因組DNA提取
        4.3.4 PCR檢測目的片段整合
        4.3.5 轉(zhuǎn)基因小鼠選擇、傳代、遺傳穩(wěn)定性及健康狀況鑒定
        4.3.6 轉(zhuǎn)基因小鼠Southern Blotting檢測
        4.3.7 激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因小鼠各組織熒光表達(dá)
        4.3.8 莖-環(huán)RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)基因小鼠中shRNA表達(dá)
        4.3.9 FMDV在抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的接毒試驗
        4.3.10 接種72h后各組織病毒量測定
    4.4 結(jié)果
        4.4.1 載體目的片段DNA的序列準(zhǔn)備
        4.4.2 通過顯微注射制備得到的轉(zhuǎn)基因小鼠
        4.4.3 F0代轉(zhuǎn)基因小鼠的外源基因整合情況
        4.4.4 轉(zhuǎn)基因小鼠的遺傳穩(wěn)定性
        4.4.5 轉(zhuǎn)基因小鼠的southern blotting檢測結(jié)果
        4.4.6 激光共聚焦顯微鏡下轉(zhuǎn)基因小鼠各組織EGFP表達(dá)情況
        4.4.7 抗口蹄疫shRNA在轉(zhuǎn)基因小鼠組織內(nèi)的表達(dá)
        4.4.8 FMDV在抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的抑制情況
        4.4.9 接種后72h各組織病毒抑制情況
    4.5 討論
    4.6 結(jié)論
第五章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文及專利情況



本文編號：3805969