本文關鍵詞：靶向豬CLTC基因的miRNA對乙腦病毒侵入Pk15細胞作用的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：乙型腦膜炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)為蟲媒病毒,屬于黃病毒科。能夠在世界范圍內(nèi)引起嚴重的急性腦膜炎疾病。豬是乙型腦膜炎病毒的貯存宿主,豬-蚊-豬,豬-蚊-人的循環(huán)傳播嚴重威脅著人類的健康,同時乙型腦炎病毒還可以造成母豬的流產(chǎn)或者死胎以及公豬的睪丸炎疾病,對畜牧業(yè)造成極大的經(jīng)濟損失。microRNA是一類內(nèi)源性的長度約20-23nt的一類非編碼RNA,在基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用,越來越多的研究表明,宿主miRNA具有抗病毒感染的作用。不同的病毒侵入不同的細胞需要不同的入胞途徑,其中,網(wǎng)格蛋白介導的包吞途徑研究的較為清楚,網(wǎng)格蛋白最基本的亞單位是由三個重鏈和三個輕鏈組成,相關研究報道,乙型腦炎病毒通過網(wǎng)格蛋白介導的胞吞途徑侵入豬腎上皮細胞系PK15,所以本項目擬以豬CLTC基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控為切入點,鑒定靶向豬CLTC基因的miRNA,并探究miRNA-clathrin包被小窩通路在乙型腦膜炎病毒侵入PK15細胞中的作用機制。本研究通過生物信息學的方法初步篩選出靶向豬CLTC基因的6條ssc-miRNA mimics,并進一步使用雙熒光素酶檢測試劑盒,Western Blot技術以及實時熒光定量PCR的方法驗證出靶向豬CLTC基因的ssc-miRNA mimics,試驗將miRNA與豬CLTC基因的配對堿基突變作為陰性對照,明確證實了靶向豬CLTC基因的ssc-miRNA mimics,并進一步驗證了miRNA與豬CLTC基因的靶向機理。采用實時熒光定量PCR的方法檢測靶向豬CLTC基因的miRNA對乙型腦膜炎病毒侵入豬PK15細胞的影響。同時,利用實時熒光定量PCR的方法檢測敲低CLTC基因表達后對乙型腦膜炎病毒侵入豬PK15細胞的影響。最后,乙型腦膜炎病毒感染豬PK15細胞以后利用實時熒光定量PCR的方法探索不同時間點miRNA和其靶基因CLTC的表達變化規(guī)律。試驗結(jié)果表明:實時熒光定量PCR,Western Blot技術以及雙熒光素酶檢測試驗相結(jié)合,驗證了靶向豬CLTC基因的2條miRNA mimics,分別是:ssc-mi R-1和ssc-miR-129-5p;利用點突變試驗證實ssc-miR-1和ssc-miR-129-5p能夠靶向豬CLTC基因,且ssc-mi R-1通過堿基配對與豬CLTC基因互補結(jié)合,完全遵循“種子規(guī)則”。而ssc-miR-129-5p抑制豬CLTC基因的表達沒有遵循“種子規(guī)則”,不具有物種保守性;定量檢測結(jié)果表明,靶向豬CLTC基因的miR-1和mi R-129-5p能夠抑制乙型腦膜炎病毒對豬PK15細胞的入侵;乙型腦膜炎病毒感染豬PK15細胞后不同時間點檢測ssc-miRNA mimics的表達變化,發(fā)現(xiàn)各ssc-miRNA mimics并無顯著的表達差異。
【關鍵詞】：乙型腦膜炎病毒 CLTC基因 miRNA mimics 生物信息學
【學位授予單位】：浙江農(nóng)林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 第一章 文獻綜述9-19
• 1.1 乙腦病毒的相關介紹9-11
• 1.1.1 乙型腦膜炎病毒的危害9-10
• 1.1.2 乙型腦膜炎病毒的結(jié)構(gòu)和功能10
• 1.1.3 乙型腦膜炎病毒的分子致病機制10-11
• 1.2 miRNA的相關介紹11-14
• 1.2.1 miRNA的發(fā)現(xiàn)11-12
• 1.2.2 miRNA的生物合成過程和作用機制12-13
• 1.2.3 miRNA與siRNA的區(qū)別與聯(lián)系13-14
• 1.3 病毒侵入細胞胞吞路徑的研究14-17
• 1.3.1 網(wǎng)格蛋白（clathrin）介導的胞吞路徑14-16
• 1.3.2 乙腦病毒侵入PK15細胞胞吞途徑的研究16-17
• 1.4 miRNA與乙腦病毒侵入PK15細胞關系的研究17-18
• 1.5 研究的目的與意義18-19
• 第二章 材料與方法19-33
• 2.1 材料19-22
• 2.2 方法22-33
• 第三章 實驗結(jié)果33-45
• 3.1 靶向豬CLTC基因miRNA的預測33
• 3.2 靶向豬CLTC基因miRNA的驗證33-39
• 3.3 靶向豬CLTC基因miRNA對乙腦病毒侵入PK15細胞的影響39-40
• 3.4 敲低豬CLTC基因表達后對乙腦病毒侵入PK15細胞的影響40-41
• 3.5 乙腦病毒侵入PK15細胞后細胞內(nèi)miRNA mimics的表達變化41-45
• 第四章 討論45-48
• 4.1 有關靶向豬CLTC基因的miRNA的預測與驗證45-46
• 4.2 有關靶向CLTC基因miRNA對乙腦病毒侵入PK15細胞的影響46-47
• 4.3 有關乙腦病毒入侵PK15細胞對miRNA mimics的影響47-48
• 第五章 小結(jié)48-49
• 5.1 研究結(jié)論48
• 5.2 本研究的創(chuàng)新之處48-49
• 第六章 作者簡介49-50
• 參考文獻50-56
• 致謝56

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