發(fā)布時(shí)間：2023-04-12 03:12

　　【目的】將Tet-on系統(tǒng)與CRISPR/Cas9系統(tǒng)相結(jié)合建立誘導(dǎo)敲除豬Sohlh1基因的細(xì)胞系�！痉椒ā糠蛛x培養(yǎng)豬胎兒成纖維細(xì)胞(PFF),進(jìn)行慢病毒載體PCW-eSpCas9(1.1)侵染并通過1μg/mL嘌呤霉素篩選及強(qiáng)力霉素(Dox)誘導(dǎo);改造pLV-sgRNA載體,進(jìn)行293FT細(xì)胞轉(zhuǎn)染驗(yàn)證;構(gòu)建含Sohlh1基因目標(biāo)靶點(diǎn)的pLV-sgRNA-2AGFP特異性載體,進(jìn)行慢病毒包裝檢測(cè);利用包裝病毒侵染穩(wěn)轉(zhuǎn)PCW-eSpCas9(1.1)的PFF細(xì)胞,3μg/mL滅稻瘟菌素進(jìn)行篩選,隨后添加Dox誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá)分析和敲除效率檢測(cè)�！窘Y(jié)果】建立了受Dox調(diào)控可誘導(dǎo)eSpCas9(1.1)蛋白表達(dá)的PFF細(xì)胞系,不添加Dox,eSpCas9(1.1)蛋白不表達(dá);293FT細(xì)胞表達(dá)綠色熒光,表明pLV-sgRNA-2A-GFP載體改造成功。3、4、6號(hào)Sohlh1基因靶點(diǎn)具有敲除活性,利用最優(yōu)的2個(gè)靶點(diǎn)構(gòu)建了pLV-sgRNA-2A-GFP特異性載體,熒光表達(dá)顯示載體慢病毒包裝成功。構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)PCW-eSpCas9(1.1)和pLVsgRNA-2A-GFP的PFF,經(jīng)Dox誘導(dǎo)72 h...

【文章頁數(shù)】：8 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 供試材料
        1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物組織
        1.1.2 質(zhì)粒和細(xì)胞株
        1.1.3 主要試劑
    1.2 方法
        1.2.1 PFF細(xì)胞的獲取
        1.2.2 PCW-eSpCas9(1.1)慢病毒載體侵染PFF細(xì)胞及檢測(cè)
        1.2.3 pLV-sgRNA載體的改造及驗(yàn)證
        1.2.4 豬Sohlh1基因的擴(kuò)增及靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)
        1.2.5 pLV-sgRNA-2A-GFP特異性載體的構(gòu)建及慢病毒包裝
        1.2.6 篩選細(xì)胞系陽性比例鑒定
2 結(jié)果與分析
    2.1 轉(zhuǎn)PCW-eSpCas9(1.1)基因細(xì)胞系的檢測(cè)
    2.2 pLV-sgRNA載體的改造結(jié)果
    2.3 豬Sohlh1基因測(cè)序及靶位點(diǎn)的選擇
    2.4 pLV-sgRNA-2A-GFP特異性載體的構(gòu)建及慢病毒包裝檢測(cè)
    2.5 慢病毒侵染PFF細(xì)胞及陽性細(xì)胞篩選結(jié)果
3 討論與結(jié)論



本文編號(hào)：3790311