內蒙古阿爾巴斯白絨山羊是我國一種獨特的生物資源,經過長期的自然選擇和人工選育成為目前世界上產絨量最高、絨纖維品質最好的品種之一。提高絨山羊產絨量,培育高產、優(yōu)質的絨山羊新品種是絨山羊育種工作目標。本實驗室已獲得轉VEGF基因的絨山羊且產絨量明顯提高,顯示出良好的育種前景。近些年,通過基因組編輯技術可以快速改變特定性狀基因組成,獲得所需優(yōu)良品種。本實驗利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術,選用高表達位點CCR5,構建CCR5基因gRNA載體和VEGF基因定點敲入載體,利用電轉染法將載體轉入絨山羊胎兒成纖維細胞中,篩選出VEGF基因在CCR5位點定點敲入的陽性細胞。將該細胞作為核供體細胞,應用體細胞核移植技術生產出VEGF基因定點整合絨山羊,以便為培育產絨量高、絨纖維品質好的絨山羊新品種提供實驗依據。1.載體構建本實驗成功構建了4對基于CCR5基因二號外顯子的gRNA表達載體,通過SURVEYOR酶切突變檢測到CCR5-gRNA4發(fā)生突變,其他三對沒有檢測到突變,確定gRNA表達載體為CCR5-gRNA4。同時成功構建了在CCR5位點定點整合VEGF基因敲入的載體P1-KV-polyA...

【文章頁數】：78 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 文獻綜述 CRISPR/Cas 系統(tǒng)概述
    一、CRISPR/CAS系統(tǒng)的歷史
    二、CRISPR/CAS系統(tǒng)的結構
    三、CRISPR/CAS系統(tǒng)的類型
    四、CRISPR/CAS系統(tǒng)的免疫作用機制
    五、CRISPR/CAS9系統(tǒng)的特點
    六、CRISPR/CAS9技術的應用
    七、CRISPR/CAS9技術目前存在的問題
    八、CRISPR/CAS9技術的展望
第二章 CRISPR/CAS9技術介導絨山羊VEGF基因定點整合的研究
    1 引言
        1.1 CRISPR/CAS9介導VEGF基因在CCR5位點定點敲入載體的構建
        1.2 CRISPR/CAS9介導VEGF基因打靶細胞系的篩選及鑒定
        1.3 定點敲入VEGF基因的絨山羊制備與檢測
    2 材料和方法
        2.1 材料
            2.1.1 主要儀器設備
            2.1.2 主要試劑及耗材
            2.1.3 實驗材料
        2.2 實驗方法
            2.2.1 絨山羊胎兒成纖維細胞電轉染法轉染條件的確定
            2.2.2 VEGF外源基因整合載體P1-KV-polyA-P2的構建
            2.2.3 絨山羊胎兒成纖維細胞分離及培養(yǎng)
            2.2.4 絨山羊胎兒成纖維細胞的解凍及復蘇
            2.2.5 絨山羊胎兒成纖維細胞的性別鑒定
            2.2.6 VEGF打靶載體P1-KV-polyA-P2轉染絨山羊胎兒成纖維細胞
            2.2.7 VEGF基因定點敲入陽性細胞的篩選
            2.2.8 VEGF基因打靶陽性細胞的鑒定
            2.2.9 體細胞核移植技術制備重構胚胎
            2.2.10 原核注射技術制備克隆胚胎
            2.2.11 移植及產羔
            2.2.12 定點整合VEGF基因絨山羊的鑒定
    3 實驗結果
        3.1 絨山羊胎兒成纖維細胞電轉染法轉染條件的確定
        3.2 gRNA表達載體設計和構建
            3.2.1 gRNA的設計
            3.2.2 gRNA表達載體的構建
            3.2.3 CRISPR/Cas9表達載體的質量檢測
            3.2.4 Surveyor突變檢測試劑盒檢測結果
        3.3 VEGF外源基因敲入載體P1-KV-polyA-P2
            3.3.1 上游同源臂(P1)下游同源臂(P2)及polyA序列的克隆
            3.3.2 打靶載體P1-KV-polyA-P2的構建
            3.3.3 打靶載體P1-KV-polyA-P2鑒定
        3.4 阿爾巴斯絨山羊胎兒成纖維細胞的分離與培養(yǎng)
        3.5 絨山羊胎兒成纖維細胞的性別鑒定
        3.6 VEGF打靶載體P1-KV-polyA-P2轉染絨山羊胎兒成纖維細胞
        3.7 VEGF基因打靶陽性細胞的鑒定
        3.8 卵母細胞體外成熟及發(fā)育
        3.9 重構胚胎移植及產羔
        3.10 定點整合VEGF基因絨山羊的鑒定
            3.10.1 新生羊PCR擴增檢測
            3.10.2 新生絨山羊皮膚組織中VEGF基因的mRNA表達情況
            3.10.3 新生絨山羊皮膚組織中VEGF基因蛋白水平表達情況
    4 討論
        4.1 CRISPR/CAS9介導VEGF基因在CCR5位點定點敲入載體的構建
        4.2 CRISPR/CAS9介導VEGF基因打靶細胞系的篩選及鑒定
        4.3 定點敲入VEGF基因的絨山羊制備與檢測
參考文獻
結論
致謝
攻讀學位期間已發(fā)表學術論文



本文編號：3779995