發(fā)布時(shí)間：2023-04-02 00:39

　　流感病毒能否感染宿主主要取決于流感病毒血凝素(hemagglutinin, HA)對(duì)宿主細(xì)胞表面受體的識(shí)別與結(jié)合。流感病毒通常識(shí)別的有唾液酸α2,3半乳糖(SAα2,3Gal)和唾液酸α2,6半乳糖(SAα2,6Gal)兩種受體類(lèi)型。大多數(shù)禽流感病毒傾向于識(shí)別SAa2,3Gal受體,而人流感病毒則傾向于識(shí)別含有SAα2,6Gal的受體。病毒受體的種類(lèi)差異對(duì)病毒的感染和復(fù)制有著重大的影響能力。MDCK細(xì)胞為流感病毒疫苗生產(chǎn)的重要細(xì)胞系之一。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),MDCK細(xì)胞既表達(dá)SAα2,3Gal,又表達(dá)SAα2,6Gal。禽流感病毒的HA主要結(jié)合SAα2,3Gal,但MDCK細(xì)胞上這種受體豐度并不高,導(dǎo)致禽流感病毒在這種細(xì)胞中的病毒滴度低。α-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶I(ST3GAL I)能夠特異催化細(xì)胞表面α2,3糖苷鍵連接結(jié)構(gòu)的形成。因此,本研究克隆了ST3GAL I基因的完整ORF區(qū),將其定向連接至pcDNA3.1 (+)真核表達(dá)載體,構(gòu)建了高效真核表達(dá)ST3GALI質(zhì)粒,命名為pcDNA3.1-ST3GAL I。將pcDNA3.1-ST3GAL I真核表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞,半定量RT...

【文章頁(yè)數(shù)】：64 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
縮略詞表
文獻(xiàn)綜述
    1 禽流感病毒概述
        1.1 禽流感病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)
        1.2 禽流感基因組結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白
    2 H9亞型禽流感流行情況
        2.1 國(guó)外流行情況
        2.2 國(guó)內(nèi)流行情況
    3 禽流感疫苗的研究進(jìn)展
        3.1 全病毒滅活疫苗
        3.2 重組活載體疫苗
        3.3 亞單位疫苗
        3.4 核酸疫苗
        3.5 反義基因工程疫苗
        3.6 新型流感疫苗
    4 流感病毒受體研究
        4.1 流感病毒受體的性質(zhì)
        4.2 與唾液酸受體相關(guān)的酶類(lèi)
            4.2.1 唾液酸酶
            4.2.2 唾液酸轉(zhuǎn)移酶
    5 流感病毒受體分布及作用
        5.1 禽類(lèi)
            5.1.1 水禽類(lèi)
            5.1.2 陸地禽類(lèi)
        5.2 哺乳動(dòng)物類(lèi)
        5.3 人類(lèi)
    6 影響流感病毒與細(xì)胞受體結(jié)合的因素
        6.1 唾液酸的鍵合類(lèi)型和糖鏈的結(jié)構(gòu)
        6.2 HA受體結(jié)合位點(diǎn)
        6.3 其他因素
引言
試驗(yàn)一 雞α-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶Ⅰ基因的克隆、序列分析及真核表達(dá)載體的構(gòu)建
    1 材料和方法
        1.1 材料
            1.1.1 載體和菌株
            1.1.2 主要試劑
            1.1.3 主要儀器
            1.1.4 試劑的配制
                1.1.4.1 瓊脂糖凝膠電泳試劑配制
                1.1.4.2 大腸桿菌轉(zhuǎn)化用溶液
                1.1.4.3 焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液的配制
                1.1.4.4 感受態(tài)細(xì)胞制備
        1.2 方法
            1.2.1 雞ST3GAL Ⅰ基因的克隆
                1.2.1.1 雞ST3GAL Ⅰ基因的引物設(shè)計(jì)與合成
                1.2.1.2 雞腸道組織總RNA的提取
                1.2.1.3 cDNA第一鏈合成
                1.2.1.4 雞ST3GAL Ⅰ基因的PCR擴(kuò)增
                1.2.1.5 PCR產(chǎn)物的回收與純化
                1.2.1.6 重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建
                1.2.1.7 重組質(zhì)粒的鑒定
                1.2.1.8 雞ST3GAL Ⅰ基因生物信息學(xué)分析
            1.2.2 pcDNA3.1-ST3GAL Ⅰ真核表達(dá)載體的構(gòu)建
                1.2.2.1 引物的設(shè)計(jì)及合成
                1.2.2.2 雞ST3GAL Ⅰ基因的擴(kuò)增
                1.2.2.3 PCR產(chǎn)物的純化回收
                1.2.2.4 PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1(+)載體的酶切回收
                1.2.2.5 目的基因與表達(dá)載體的連接
                1.2.2.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
                1.2.2.7 重組質(zhì)粒的鑒定
    2 結(jié)果與分析
        2.1 雞ST3GAL Ⅰ基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果
        2.2 重組克隆質(zhì)粒pGEM-ST3GAL Ⅰ的鑒定
        2.3 雞ST3GAL Ⅰ基因測(cè)序結(jié)果及序列分析
        2.4 不同物種ST3Gal Ⅰ基因的同源性分析
        2.5 重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-ST3GAL Ⅰ的鑒定
    3 討論
試驗(yàn)二 MDCK細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化及pcDNA3.1-ST3GAL Ⅰ在MDCK細(xì)胞上的表達(dá)
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 質(zhì)粒和細(xì)胞
            1.1.2 主要試劑
            1.1.3 主要儀器
            1.1.4 所需溶液配制
        1.2 方法
            1.2.1 pcDNA3.1-EGFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建
                1.2.1.1 引物的設(shè)計(jì)及合成
                1.2.1.2 EGFP基因的擴(kuò)增
                1.2.1.3 PCR產(chǎn)物的純化回收
                1.2.1.4 PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1(+)載體的酶切回收
                1.2.1.5 目的基因與表達(dá)載體的連接
                1.2.1.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
                1.2.1.7 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
            1.2.2 MDCK細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化
                1.2.2.1 細(xì)胞準(zhǔn)備
                1.2.2.2 無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒制備
                1.2.2.3 pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞
                1.2.2.4 質(zhì)粒與脂質(zhì)體比例對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響
                1.2.2.5 質(zhì)粒用量對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響
                1.2.2.6 細(xì)胞密度對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響
            1.2.3 pcDNA3.1-ST3GAL Ⅰ真核表達(dá)載體在MDCK細(xì)胞的表達(dá)
            1.2.4 RT-PCR檢測(cè)ST3GALⅠ基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)
                1.2.4.1 內(nèi)參基因合成
                1.2.4.2 細(xì)胞總RNA的提取
                1.2.4.3 RNA中DNA的消化
                1.2.4.4 總RNA含量測(cè)定
                1.2.4.5 cDNA的合成
                1.2.4.6 ST3GALⅠ基因的擴(kuò)增
                1.2.4.7 內(nèi)參GAPDH基因的擴(kuò)增
    2 結(jié)果與分析
        2.1 pcDNA3.1-EGFP真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
            2.1.1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒PCR鑒定
            2.1.2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP酶切鑒定
        2.2 pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞條件優(yōu)化
            2.2.1 質(zhì)粒與脂質(zhì)體比例對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響
            2.2.2 質(zhì)粒用量對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響
            2.2.3 細(xì)胞密度對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響
        2.3 RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞后ST3GAL Ⅰ基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)
            2.3.1 細(xì)胞總RNA完整性及純度檢測(cè)
            2.3.2 RT-PCR檢測(cè)ST3GAL基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)
    3 討論
試驗(yàn)三 H9亞型禽流感病毒在過(guò)表達(dá)ST3GAL Ⅰ基因的MDCK細(xì)胞上的增殖情況
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 毒株
            1.1.2 細(xì)胞與質(zhì)粒
            1.1.3 主要試劑
            1.1.4 主要儀器
            1.1.5 所需試劑配制
        1.2 方法
            1.2.1 H9亞型禽流感病毒在MDCK細(xì)胞上的增殖
            1.2.2 H9亞型禽流感病毒HA試驗(yàn)
            1.2.3 H9亞型禽流感病毒TCID50的測(cè)定
    2 結(jié)果
        2.1 轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組CPE結(jié)果
        2.2 HA結(jié)果
        2.3 TCID50測(cè)定結(jié)果
    3 討論
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
英文摘要
附錄



本文編號(hào)：3778175