發(fā)布時間：2023-04-02 00:39

　　流感病毒能否感染宿主主要取決于流感病毒血凝素(hemagglutinin, HA)對宿主細胞表面受體的識別與結(jié)合。流感病毒通常識別的有唾液酸α2,3半乳糖(SAα2,3Gal)和唾液酸α2,6半乳糖(SAα2,6Gal)兩種受體類型。大多數(shù)禽流感病毒傾向于識別SAa2,3Gal受體,而人流感病毒則傾向于識別含有SAα2,6Gal的受體。病毒受體的種類差異對病毒的感染和復(fù)制有著重大的影響能力。MDCK細胞為流感病毒疫苗生產(chǎn)的重要細胞系之一。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn),MDCK細胞既表達SAα2,3Gal,又表達SAα2,6Gal。禽流感病毒的HA主要結(jié)合SAα2,3Gal,但MDCK細胞上這種受體豐度并不高,導(dǎo)致禽流感病毒在這種細胞中的病毒滴度低。α-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶I(ST3GAL I)能夠特異催化細胞表面α2,3糖苷鍵連接結(jié)構(gòu)的形成。因此,本研究克隆了ST3GAL I基因的完整ORF區(qū),將其定向連接至pcDNA3.1 (+)真核表達載體,構(gòu)建了高效真核表達ST3GALI質(zhì)粒,命名為pcDNA3.1-ST3GAL I。將pcDNA3.1-ST3GAL I真核表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染MDCK細胞,半定量RT...

【文章頁數(shù)】：64 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
縮略詞表
文獻綜述
    1 禽流感病毒概述
        1.1 禽流感病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)
        1.2 禽流感基因組結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白
    2 H9亞型禽流感流行情況
        2.1 國外流行情況
        2.2 國內(nèi)流行情況
    3 禽流感疫苗的研究進展
        3.1 全病毒滅活疫苗
        3.2 重組活載體疫苗
        3.3 亞單位疫苗
        3.4 核酸疫苗
        3.5 反義基因工程疫苗
        3.6 新型流感疫苗
    4 流感病毒受體研究
        4.1 流感病毒受體的性質(zhì)
        4.2 與唾液酸受體相關(guān)的酶類
            4.2.1 唾液酸酶
            4.2.2 唾液酸轉(zhuǎn)移酶
    5 流感病毒受體分布及作用
        5.1 禽類
            5.1.1 水禽類
            5.1.2 陸地禽類
        5.2 哺乳動物類
        5.3 人類
    6 影響流感病毒與細胞受體結(jié)合的因素
        6.1 唾液酸的鍵合類型和糖鏈的結(jié)構(gòu)
        6.2 HA受體結(jié)合位點
        6.3 其他因素
引言
試驗一 雞α-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶Ⅰ基因的克隆、序列分析及真核表達載體的構(gòu)建
    1 材料和方法
        1.1 材料
            1.1.1 載體和菌株
            1.1.2 主要試劑
            1.1.3 主要儀器
            1.1.4 試劑的配制
                1.1.4.1 瓊脂糖凝膠電泳試劑配制
                1.1.4.2 大腸桿菌轉(zhuǎn)化用溶液
                1.1.4.3 焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液的配制
                1.1.4.4 感受態(tài)細胞制備
        1.2 方法
            1.2.1 雞ST3GAL Ⅰ基因的克隆
                1.2.1.1 雞ST3GAL Ⅰ基因的引物設(shè)計與合成
                1.2.1.2 雞腸道組織總RNA的提取
                1.2.1.3 cDNA第一鏈合成
                1.2.1.4 雞ST3GAL Ⅰ基因的PCR擴增
                1.2.1.5 PCR產(chǎn)物的回收與純化
                1.2.1.6 重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建
                1.2.1.7 重組質(zhì)粒的鑒定
                1.2.1.8 雞ST3GAL Ⅰ基因生物信息學(xué)分析
            1.2.2 pcDNA3.1-ST3GAL Ⅰ真核表達載體的構(gòu)建
                1.2.2.1 引物的設(shè)計及合成
                1.2.2.2 雞ST3GAL Ⅰ基因的擴增
                1.2.2.3 PCR產(chǎn)物的純化回收
                1.2.2.4 PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1(+)載體的酶切回收
                1.2.2.5 目的基因與表達載體的連接
                1.2.2.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
                1.2.2.7 重組質(zhì)粒的鑒定
    2 結(jié)果與分析
        2.1 雞ST3GAL Ⅰ基因的RT-PCR擴增結(jié)果
        2.2 重組克隆質(zhì)粒pGEM-ST3GAL Ⅰ的鑒定
        2.3 雞ST3GAL Ⅰ基因測序結(jié)果及序列分析
        2.4 不同物種ST3Gal Ⅰ基因的同源性分析
        2.5 重組真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-ST3GAL Ⅰ的鑒定
    3 討論
試驗二 MDCK細胞轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化及pcDNA3.1-ST3GAL Ⅰ在MDCK細胞上的表達
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 質(zhì)粒和細胞
            1.1.2 主要試劑
            1.1.3 主要儀器
            1.1.4 所需溶液配制
        1.2 方法
            1.2.1 pcDNA3.1-EGFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建
                1.2.1.1 引物的設(shè)計及合成
                1.2.1.2 EGFP基因的擴增
                1.2.1.3 PCR產(chǎn)物的純化回收
                1.2.1.4 PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1(+)載體的酶切回收
                1.2.1.5 目的基因與表達載體的連接
                1.2.1.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
                1.2.1.7 重組表達質(zhì)粒的鑒定
            1.2.2 MDCK細胞轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化
                1.2.2.1 細胞準備
                1.2.2.2 無內(nèi)毒素質(zhì)粒制備
                1.2.2.3 pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDCK細胞
                1.2.2.4 質(zhì)粒與脂質(zhì)體比例對轉(zhuǎn)染效率的影響
                1.2.2.5 質(zhì)粒用量對轉(zhuǎn)染效率的影響
                1.2.2.6 細胞密度對轉(zhuǎn)染效率的影響
            1.2.3 pcDNA3.1-ST3GAL Ⅰ真核表達載體在MDCK細胞的表達
            1.2.4 RT-PCR檢測ST3GALⅠ基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達
                1.2.4.1 內(nèi)參基因合成
                1.2.4.2 細胞總RNA的提取
                1.2.4.3 RNA中DNA的消化
                1.2.4.4 總RNA含量測定
                1.2.4.5 cDNA的合成
                1.2.4.6 ST3GALⅠ基因的擴增
                1.2.4.7 內(nèi)參GAPDH基因的擴增
    2 結(jié)果與分析
        2.1 pcDNA3.1-EGFP真核表達質(zhì)粒的鑒定
            2.1.1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒PCR鑒定
            2.1.2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP酶切鑒定
        2.2 pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDCK細胞條件優(yōu)化
            2.2.1 質(zhì)粒與脂質(zhì)體比例對轉(zhuǎn)染效率的影響
            2.2.2 質(zhì)粒用量對轉(zhuǎn)染效率的影響
            2.2.3 細胞密度對轉(zhuǎn)染效率的影響
        2.3 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染MDCK細胞后ST3GAL Ⅰ基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達
            2.3.1 細胞總RNA完整性及純度檢測
            2.3.2 RT-PCR檢測ST3GAL基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達
    3 討論
試驗三 H9亞型禽流感病毒在過表達ST3GAL Ⅰ基因的MDCK細胞上的增殖情況
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 毒株
            1.1.2 細胞與質(zhì)粒
            1.1.3 主要試劑
            1.1.4 主要儀器
            1.1.5 所需試劑配制
        1.2 方法
            1.2.1 H9亞型禽流感病毒在MDCK細胞上的增殖
            1.2.2 H9亞型禽流感病毒HA試驗
            1.2.3 H9亞型禽流感病毒TCID50的測定
    2 結(jié)果
        2.1 轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組CPE結(jié)果
        2.2 HA結(jié)果
        2.3 TCID50測定結(jié)果
    3 討論
全文總結(jié)
參考文獻
英文摘要
附錄



本文編號：3778175