益生乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)菌體較大,不存在內(nèi)毒素,可以吸附黏膜細(xì)胞上并定居于黏膜表層。因此,乳酸菌是表達(dá)和傳遞治療性和預(yù)防性外源蛋白的首選載體。禽β-防御素(AvBDs)是主要存在于天然黏膜系統(tǒng)的天然抗菌肽之一,主要發(fā)揮抗感染、廣譜抗菌和廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用,特別是禽β-防御素是一種小的陽(yáng)離子非糖基化的多肽,非常適合于原核表達(dá)。因此,本研究采用食品級(jí)乳酸乳球菌NZ3900宿主菌株,構(gòu)建了完全食品級(jí)表達(dá)禽β-防御素的重組乳酸菌。本研究利用3種表達(dá)質(zhì)粒和食品級(jí)宿主菌株構(gòu)建了3套表達(dá)禽β-防御素的重組乳酸菌。采用的3種表達(dá)系統(tǒng)和食品級(jí)乳酸乳球菌NZ3900菌株作為宿主菌株,分別構(gòu)建了表達(dá)禽β-防御素1(AvBD1)、禽β-防御素2(AvBD2)、禽β-防御素6(AvBD6)、禽β-防御素13(AvBD13)和融合禽β-防御素1/2/6/13功能片段組成的融合禽β-防御素AvBD12613,共11株重組乳酸菌,其中5株重組乳酸菌的表達(dá)量穩(wěn)定,蛋白大小正確,是本研究用于體外篩選和體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證的重組乳酸菌。利用表達(dá)β-防御素的重組乳酸菌的菌體裂解混合物體與巨噬...

【文章頁(yè)數(shù)】：81 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
主要符號(hào)對(duì)照表
第一章 緒論
    1.1 乳酸菌概述
    1.2 乳酸菌活載體表達(dá)系統(tǒng)
        1.2.1 宿主菌的選擇
        1.2.2 乳酸菌表達(dá)方式的選擇
        1.2.3 乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)及展望
    1.3 免疫佐劑及免疫增強(qiáng)劑
        1.3.1 免疫增強(qiáng)劑的定義及分類
        1.3.2 免疫增強(qiáng)劑的作用機(jī)制
        1.3.3 免疫佐劑的定義及分類
        1.3.4 免疫佐劑的作用機(jī)制
        1.3.5 免疫佐劑及免疫增強(qiáng)劑的研究現(xiàn)狀及展望
    1.4 禽β-防御素概述
        1.4.1 禽β-防御素的定義及分類
        1.4.2 禽β-防御素的免疫學(xué)功能
        1.4.3 禽β-防御素作為免疫佐劑或免疫增強(qiáng)劑的研究進(jìn)展及展望
        1.4.4 新城疫滅活疫苗及其免疫佐劑
        1.4.5 新城疫活疫苗及其免疫佐劑
    1.5 目的與意義
第二章 表達(dá)禽β-防御素的重組乳酸菌的構(gòu)建
    2.1 材料
        2.1.1 質(zhì)粒和菌株
        2.1.2 主要試劑和儀器
    2.2 方法
        2.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成
        2.2.2 目的片段的線性擴(kuò)增
        2.2.3 目的片段的膠回收
        2.2.4 宿主菌株NZ3900感受態(tài)的制備
        2.2.5 重組質(zhì)粒pNZ8149-Av BDs構(gòu)建
        2.2.6 重組質(zhì)粒pNZ8149-Nis RK-Cm-Av BDs的構(gòu)建
        2.2.7 重組質(zhì)粒pNZ2103-Av BDs構(gòu)建
        2.2.8 重組乳酸菌的構(gòu)建
        2.2.9 重組乳酸菌的鑒定
        2.2.10 重組乳酸菌的誘導(dǎo)表達(dá)
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 目的基因片段的擴(kuò)增
        2.3.2 重組乳酸菌r-L.Lactis-pNZ8149-AvBDs的篩選及PCR鑒定
        2.3.3 重組乳酸菌r-L.Lactis-pNZ8149-NisRK-Cm-Av BDs的篩選及PCR鑒定
        2.3.4 重組乳酸菌r-L.Lactis-pNZ2103-AvBDs的篩選及PCR鑒定
        2.3.5 重組乳酸菌r-L.Lactis-pNZ8149-AvBDs目的蛋白的表達(dá)鑒定
        2.3.6 重組乳酸菌r-L.Lactis-pNZ8149-NisRK-Cm-Av BDs目的蛋白的表達(dá)鑒定
        2.3.7 重組乳酸菌r-L.Lactis-pNZ2103-AvBDs目的蛋白的表達(dá)鑒定
    2.4 表達(dá)禽β-防御素重組乳酸菌菌體裂解混合物的制備
    2.5 討論
第三章 重組禽β-防御素體外免疫調(diào)節(jié)活性的檢測(cè)
    3.1 材料
        3.1.1 細(xì)胞
        3.1.2 主要試劑及儀器
    3.2 方法
        3.2.1 重組禽β-防御素激活J774-Dual^TM報(bào)告細(xì)胞系免疫信號(hào)通路的檢測(cè)
        3.2.2 重組β-防御素刺激PBMCs產(chǎn)生細(xì)胞因子的檢測(cè)
        3.2.3 重組β-防御素刺激雞巨噬細(xì)胞(HD11)產(chǎn)生細(xì)胞因子的檢測(cè)
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 重組禽β-防御素激活J774-Dual^TM報(bào)告細(xì)胞系免疫信號(hào)通路的檢測(cè)
        3.3.2 重組β-防御素刺激PBMCs產(chǎn)生細(xì)胞因子的檢測(cè)
        3.3.3 重組β-防御素激活PBMCs CD80及CD86 分子的檢測(cè)
        3.3.4 重組β-防御素激活HD11IL-10的檢測(cè)
        3.3.5 重組β-防御素激活HD11 CD80和CD86 分子的檢測(cè)
    3.4 討論
第四章 重組β-防御素作為新城疫活疫苗免疫佐劑的初步研究
    4.1 材料
        4.1.1 毒株、動(dòng)物及疫苗
        4.1.2 主要試劑與儀器
    4.2 方法
        4.2.1 新城疫活疫苗、重組β-防御素免疫佐劑制備及注射劑量
        4.2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案
        4.2.3 血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)血清抗體滴度
        4.2.4 ELISA檢測(cè)血清細(xì)胞因子的含量
        4.2.5 PBMCs和外周血白細(xì)胞的活性檢測(cè)
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 ELISA檢測(cè)血清中細(xì)胞因子
        4.3.2 PBMCs和外周血白細(xì)胞增殖活性
        4.3.3 LPS激活PBMCs和外周血白細(xì)胞增殖活性檢測(cè)
        4.3.4 NDV攻毒PBMCs和外周血白細(xì)胞后增殖活性檢測(cè)
        4.3.5 HA和HI試驗(yàn)檢測(cè)血清抗體滴度
    4.4 討論
第五章 重組β-防御素作為新城疫油乳劑滅活疫苗免疫佐劑的研究
    5.1 材料
        5.1.1 毒株、動(dòng)物及疫苗
        5.1.2 主要試劑與儀器
    5.2 方法
        5.2.1 重組β-防御素免疫佐劑新城疫滅活疫苗的制備及注射劑量
        5.2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案
        5.2.3 血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)血清抗體滴度
        5.2.4 ELISA檢測(cè)血清細(xì)胞因子的含量
        5.2.5 PBMCs和外周血白細(xì)胞的增殖活性檢測(cè)
    5.3 結(jié)果
        5.3.1 ELISA檢測(cè)血清中細(xì)胞因子
        5.3.2 PBMCs和外周血白細(xì)胞增殖活性
        5.3.3 LPS激活PBMCs和外周血白細(xì)胞增殖活性
        5.3.4 HA和HI試驗(yàn)檢測(cè)血清抗體滴度
    5.4 討論
第六章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3770794