單鏈抗體（single-chain variable Fragment，scFv）主要是從雜交瘤細(xì)胞、免疫小鼠的脾細(xì)胞和人的B淋巴細(xì)胞獲得。scFv是由重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)構(gòu)成的非共價(jià)二聚體，可以用來構(gòu)建重組scFv抗體。首先，從雜交瘤細(xì)胞（或脾細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓）分離mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行抗體基因PCR。通過這種方法，建立了含有不同種類VH和VL基因的抗體庫。單鏈抗體結(jié)構(gòu)包括重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL），VH和VL通過一段柔性肽連接，使得scFv能在E.coli中表達(dá)成具有功能性的蛋白，這種結(jié)構(gòu)增加了scFv的高親和力和特異性。 實(shí)驗(yàn)將構(gòu)建的口蹄疫病毒scFv基因與T7Select10-3b載體連接，經(jīng)體外包裝，BLT5403菌株增殖，文庫擴(kuò)增，進(jìn)行體外親和篩選，建立了T7噬菌體cDNA展示文庫。擴(kuò)增核糖體展示篩選的scFv基因，將目的片段與真核表達(dá)載體pEGFP-N1連接，構(gòu)建融合真核表達(dá)載體pEGFP-N1-scFv。將pEGFP-N1-scFv質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染進(jìn)CHO細(xì)胞中，在熒光顯微鏡下觀察目的蛋白表達(dá)情況。...

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【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 重組抗體技術(shù)
    1.2 單鏈抗體SCFV
    1.3 SCFV 抗體的分型
    1.4 SCFV 的表達(dá)
    1.5 噬菌體展示技術(shù)
    1.6 噬菌體展示SCFV的優(yōu)勢
    1.7 應(yīng)用
        1.7.1 醫(yī)療應(yīng)用
        1.7.2 診斷應(yīng)用
        1.7.3 scFv 在口蹄疫方面的應(yīng)用
第二章 口蹄疫病毒單鏈抗體 CDNAT7 噬菌體展示文庫的構(gòu)建
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.3 脾細(xì)胞、載體及菌株
        2.1.4 主要溶液及配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 抗口蹄疫單鏈抗體的構(gòu)建
        2.2.2 連接 scFv 和 T7 噬菌體載體
        2.2.3 菌體體外包裝
        2.2.4 文庫滴度的測定
        2.2.5 噬菌斑鑒定
        2.2.6 文庫的擴(kuò)增
        2.2.7 文庫篩選
        2.2.8 插入片段的序列測定
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 scFv 的構(gòu)建
        2.3.2 T7 噬菌體展示文庫的鑒定
    2.4 討論
第三章 口蹄疫病毒單鏈抗體在 CHO 細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.1.2 基因、載體和表達(dá)細(xì)胞
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.1.4 主要溶液及其配置方法
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 引物設(shè)計(jì)
        3.2.2 目的基因克隆
        3.2.3 PCR 產(chǎn)物純化與回收
        3.2.4 回收產(chǎn)物及真核表達(dá)載體的酶切、連接與轉(zhuǎn)化
        3.2.5 目的基因與真核表達(dá)載體的連接
        3.2.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        3.2.7 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
        3.2.8 重組表達(dá)質(zhì)粒的大抽提
        3.2.9 CHO 細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)與凍存
        3.2.10 CHO 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
        3.2.11 目的蛋白的亞細(xì)胞定位
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 目的基因的克隆
        3.3.2 重組真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
        3.3.3 質(zhì)粒 scFv- pEGFP-N1 小量制備的濃度及 OD 值
        3.3.4 CHO 細(xì)胞的培養(yǎng)
        3.3.5 目的蛋白在 CHO 細(xì)胞中的表達(dá)
        3.3.6 目的蛋白的亞細(xì)胞定位
    3.4 討論
第四章 口蹄疫病毒單鏈抗體的可溶性表達(dá)及鑒定
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.1.3 載體及宿主細(xì)胞
        4.1.4 主要溶液及配方
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 scFv 基因的克隆
        4.2.2 scFv 基因片段和載體 pSMK 的酶切
        4.2.3 scFv 基因片段和載體 pSMK 的連接
        4.2.4 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        4.2.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
        4.2.6 融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)入表達(dá)菌中
        4.2.7 16℃大量誘導(dǎo)表達(dá)及純化
        4.2.8 口蹄疫病毒 scFv 與 FMDV 親和力和特異性的 ELISA 鑒定
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 融合表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.3.2 抗口蹄疫病毒 scFv 的表達(dá)及純化
        4.3.3 ELISA 鑒定
    4.4 討論
第五章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡歷



本文編號(hào)：3767071