發(fā)布時間：2023-03-12 20:12

　　水貂圓環(huán)病毒(Mink Circovirus,MiCV)是2014年發(fā)現(xiàn)的一種與水貂腹瀉有關(guān)的新型圓環(huán)病毒。目前,對于MiCV的病原學、流行情況和致病機理的研究較少,病毒的傳播方式等研究未見報導,MiCV對于水貂養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟影響仍未知。因此,對于MiCV的高效、準確、特異性的檢測方法的建立顯得尤為重要。目前已報道的檢測方法只有常規(guī)PCR及RPA方法,對于水貂圓環(huán)病毒抗體的檢測及病毒定量檢測未見報道。本研究首先根據(jù)MiCV的Cap基因設(shè)計特異性引物,構(gòu)建含目的片段的標準質(zhì)粒建立實時定量PCR(Real-time Quantitative PCR,RT-qPCR)的方法,繪制了標準曲線方程Y=-3.155X+39.202,得到各個參數(shù)分別為:擴增效率為107.447%,斜率為-3.155,相關(guān)系數(shù)(R²)為0.974。最低可檢測到10¹ copies/μL,重復性較好。應用RT-qPCR方法定量檢測來自不同省份水貂組織、糞便、血清樣品,陽性率分別為:山東52.88%、河北67.90%、遼寧58.46%、吉林38.46%、黑龍江30.30%,總陽性...

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 圓環(huán)病毒的概述
    1.2 圓環(huán)病毒的致病機制
    1.3 水貂圓環(huán)病毒
        1.3.1 水貂圓環(huán)病毒的發(fā)現(xiàn)
        1.3.2 水貂圓環(huán)病毒基因組結(jié)構(gòu)
        1.3.3 水貂圓環(huán)病流行情況
        1.3.4 水貂圓環(huán)病診斷技術(shù)
        1.3.5 研究展望
    1.4 實時定量PCR技術(shù)優(yōu)點及應用
    1.5 間接ELISA技術(shù)優(yōu)點及應用
    1.6 研究的目的和意義
2 材料和方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 載體
        2.1.2 主要酶類及試劑
        2.1.3 主要溶劑的配制
        2.1.4 試驗儀器和設(shè)備
        2.1.5 病毒、血清、病料
    2.2 實時定量PCR檢測方法的建立及應用
        2.2.1 基因擴增
        2.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.3 重組質(zhì)粒DNA標準品的制備
        2.2.4 實時定量PCR反應條件優(yōu)化
        2.2.5 標準曲線建立
        2.2.6 特異性試驗
        2.2.7 重復性試驗
        2.2.8 臨床樣品的檢測與驗證
    2.3 人工感染試驗
        2.3.1 病毒的制備
        2.3.2 實驗動物
        2.3.3 MiCV人工感染水貂及樣品采集
        2.3.4 樣品處理
        2.3.5 檢測MiCV感染水貂后病毒分布情況
    2.4 水貂圓環(huán)病毒全基因組序列分析
        2.4.1 病毒DNA模板的制備
        2.4.2 MiCV全基因組引物的設(shè)計與合成
        2.4.3 MiCV全基因組的PCR擴增
        2.4.4 擴增產(chǎn)物的回收
        2.4.5 目的片段與pMD-T載體的連接和轉(zhuǎn)化
        2.4.6 基因組分析
    2.5 間接ELISA檢測方法的建立及應用
        2.5.1 引物的設(shè)計與合成
        2.5.2 重組蛋白的包涵體表達分析及純化
        2.5.3 間接ELISA條件優(yōu)化
        2.5.4 判定標準的測定
        2.5.5 特異性試驗
        2.5.6 批內(nèi)及批間重復性試驗
        2.5.7 間接ELISA方法與Western Blot方法比較
        2.5.8 臨床樣品的檢測與驗證
3 結(jié)果
    3.1 實時定量PCR檢測方法的建立及應用
        3.1.1 Cap基因PCR擴增結(jié)果
        3.1.2 pMDT-cap重組質(zhì)粒的鑒定
        3.1.3 標準品
        3.1.4 實時定量PCR最佳反應條件
        3.1.5 標準曲線建立
        3.1.6 特異性試驗
        3.1.7 重復性試驗
        3.1.8 臨床樣品的檢測結(jié)果
    3.2 人工感染試驗
        3.2.1 MiCV人工感染水貂疾病模型臨床癥狀
        3.2.2 檢測MiCV感染水貂后病毒分布情況
        3.2.3 MiCV在感染水貂中不同組織感染率
    3.3 水貂圓環(huán)病毒全基因組序列分析
        3.3.1 MiCV全基因組擴增結(jié)果
        3.3.2 重組質(zhì)粒的鑒定
        3.3.3 序列測定結(jié)果
        3.3.4 MiCV同源性、遺傳變異及進化分析
    3.4 間接ELISA檢測方法的建立及應用
        3.4.1 重組質(zhì)粒的鑒定和表達
        3.4.2 重組蛋白的包涵體表達分析及純化
        3.4.3 重組蛋白純化后Western Blot鑒定
        3.4.4 間接ELISA最佳反應條件
        3.4.5 判定標準的確定
        3.4.6 批內(nèi)及批間重復性試驗
        3.4.7 特異性試驗
        3.4.8 間接ELISA方法與WesternBlot方法比較
        3.4.9 臨床樣品的檢測結(jié)果
4 討論
    4.1 實時定量PCR檢測方法的建立及檢測
    4.2 間接ELISA檢測方法的建立及檢測
    4.3 建立的實時定量PCR方法與間接ELISA方法比較
    4.4 水貂圓環(huán)病毒全基因組序列分析
    4.5 MiCV在感染水貂組織中分布情況
    4.6 MiCV在不同省份流行分布情況
    4.7 根據(jù)目前研究對于MiCV的評估
5 結(jié)論
致謝
參考文獻
攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術(shù)論文



本文編號：3761873