本研究旨在建立牛呼吸道合胞體病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)快速檢測(cè)方法。通過(guò)查閱中外相關(guān)文獻(xiàn),設(shè)計(jì)并篩選出一對(duì)引物用于特異性擴(kuò)增BRSV核衣殼(N)蛋白基因片段。對(duì)該目的基因進(jìn)行克隆和測(cè)序后通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)制備cRNA,計(jì)算體系中RNA的濃度;分裝后驗(yàn)證其重復(fù)性與穩(wěn)定性,并借助數(shù)字PCR進(jìn)行聯(lián)合定值確定參考品的最終濃度;使用該BRSV參考品作為模板,設(shè)計(jì)引物和探針,通過(guò)反應(yīng)條件的優(yōu)化,建立了BRSV RT-qPCR快速檢測(cè)方法,并對(duì)其靈敏度、特異性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,制備的BRSV參考品定值結(jié)果為(1.11±0.04)×10¹¹ 拷貝數(shù)/mL。所建立的RT-qPCR快速檢測(cè)方法能有效鑒定BRSV核酸參考品,最低可檢出病毒核酸10⁴拷貝數(shù)/mL;與另外8種反芻動(dòng)物病原均無(wú)非特異性擴(kuò)增,特異性強(qiáng);對(duì)臨床樣本檢測(cè)的結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致性達(dá)100%。結(jié)果顯示,本研究建立的BRSV RT-qPCR快速檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高,具有較大的臨床應(yīng)用價(jià)...

【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 病毒來(lái)源
    1.2 主要試劑
    1.3 核酸提取
    1.4 BRSV核衣殼(N)蛋白基因的擴(kuò)增、克隆和序列分析
    1.5 體外轉(zhuǎn)錄病毒RNA制備BRSV參考品
    1.6 BRSV RT-qPCR方法的建立和優(yōu)化
    1.7 特異性試驗(yàn)
    1.8 靈敏度試驗(yàn)
    1.9 重復(fù)性試驗(yàn)
    1.10 臨床樣本檢測(cè)驗(yàn)證
2 結(jié)果
    2.1 BRSV-N基因的擴(kuò)增、克隆和測(cè)序
    2.2 BRSVcRNA參考品的制備與定值
    2.3 BRSV RT-qPCR檢測(cè)方法的建立和反應(yīng)條件優(yōu)化
    2.4 特異性試驗(yàn)
    2.5 靈敏度試驗(yàn)
    2.6 重復(fù)性試驗(yàn)
    2.7 臨床樣本的檢測(cè)
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