禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)可引起家禽嚴(yán)重的呼吸道感染和全身性疾病,嚴(yán)重威脅家禽業(yè)的健康發(fā)展。另外,APEC屬于腸道外致病性大腸桿菌(Extraintestinal Pathogenic E.coli,ExPEC),其與人源ExPEC具有高度的同源性及相似的致病機制,可作為毒力基因與耐藥基因的儲庫,具有潛在的公共衛(wèi)生意義。在感染過程中,APEC一方面通過分泌系統(tǒng)發(fā)揮作用,另一方面通過調(diào)控系統(tǒng)控制毒力因子適時表達,促進其生存及致病。分泌系統(tǒng)是致病菌進化過程中形成的特定毒力因子,其可通過分泌效應(yīng)因子擾亂宿主免疫應(yīng)答反應(yīng),從而發(fā)揮致病作用。病原菌通過雙組分系統(tǒng)感應(yīng)外界環(huán)境,進而調(diào)控基因適時表達,促進其生存及致病。本實驗室前期研究表明,大腸桿菌III型分泌系統(tǒng)2(E.coli Type III secretion system 2,ETT2)和Ⅵ型分泌系統(tǒng)2(TypeⅥsecretion system 2,T6SS2)存在并參與APEC的胞內(nèi)存活、菌間競爭能力等致病過程。然而,ETT2效應(yīng)因子的致病作用及T6SS2的調(diào)控機制尚...

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【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
主要符號對照表
第一章 緒論
    1.1 禽致病性大腸桿菌概述
    1.2 禽致病性大腸桿菌的危害
    1.3 禽致病性大腸桿菌的毒力因子
        1.3.1 T3SS概述
        1.3.2 T3SS與細菌毒力的關(guān)系
        1.3.3 T3SS的效應(yīng)因子
        1.3.4 ETT2概述
        1.3.5 ETT2對細菌毒力的影響
        1.3.6 APEC T6SS概述
        1.3.7 Cpx雙組分系統(tǒng)
    1.4 禽致病性大腸桿菌的防治
        1.4.1 環(huán)境控制
        1.4.2 提高機體免疫
        1.4.3 藥物治療
第二章 禽致病性大腸桿菌ETT2效應(yīng)因子的篩選及鑒定
    2.1 材料和方法
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 試驗主要試劑
        2.1.3 主要儀器設(shè)備
        2.1.4 引物設(shè)計
        2.1.5 eivC基因缺失株的構(gòu)建及鑒定
        2.1.6 生長曲線測定
        2.1.7 RNA提取
        2.1.8 qPCR檢測基因的相對轉(zhuǎn)錄水平
        2.1.9 分泌蛋白的提取
        2.1.10 分泌蛋白的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
        2.1.11 疑似效應(yīng)因子的功能預(yù)測
        2.1.12 ETT2效應(yīng)因子的驗證
        2.1.13 效應(yīng)因子EspE3表達與純化
        2.1.14 效應(yīng)因子EspE3體外泛素化試驗
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 eivC基因缺失株的構(gòu)建
        2.2.2 生長曲線測定
        2.2.3 ETT2核心基因不同時間的轉(zhuǎn)錄水平分析
        2.2.4 分泌蛋白的提取及質(zhì)譜分析
        2.2.5 分泌蛋白的生物信息學(xué)分析
        2.2.6 ETT2 效應(yīng)因子Esp E3 的驗證
        2.2.7 效應(yīng)因子EspE3的表達及純化
        2.2.8 EspE3的E3泛素連接酶活性檢測
    2.3 討論
第三章 ETT2 效應(yīng)因子Esp E3 對禽致病性大腸桿菌毒力的影響
    3.1 材料和方法
        3.1.1 菌株、細胞系、質(zhì)粒
        3.1.2 試驗動物
        3.1.3 主要試劑
        3.1.4 主要儀器設(shè)備
        3.1.5 引物設(shè)計
        3.1.6 效應(yīng)因子espE3基因缺失株構(gòu)建
        3.1.7 效應(yīng)因子espE3基因互補株構(gòu)建
        3.1.8 效應(yīng)因子真核表達載體構(gòu)建
        3.1.9 生長曲線及運動性測定
        3.1.10 細胞黏附及侵襲試驗
        3.1.11 致病性測定
        3.1.12 體內(nèi)載菌量測定
        3.1.13 細胞因子轉(zhuǎn)錄水平檢測
        3.1.14 GST-Esp E3 融合蛋白表達及純化
        3.1.15 GST pull-down篩選Esp E3 的宿主互作蛋白
        3.1.16 統(tǒng)計學(xué)分析
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 ETT2 效應(yīng)因子EspE3 基因缺失株與互補株構(gòu)建
        3.2.2 真核表達質(zhì)粒構(gòu)建
        3.2.3 生長曲線與運動性測定
        3.2.4 細胞黏附及侵襲
        3.2.5 致病力測定
        3.2.6 體內(nèi)載菌量測定
        3.2.7 細胞因子檢測
        3.2.8 GST-EspE3 蛋白表達與純化結(jié)果
        3.2.9 GST pull-down篩選ETT2 效應(yīng)因子EspE3 的宿主互作蛋白
    3.3 討論
第四章 雙組分系統(tǒng)CpxR調(diào)控T6SS2 促進禽致病性大腸桿菌毒力的分子機制
    4.1 材料和方法
        4.1.1 菌株和質(zhì)粒
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要儀器設(shè)備
        4.1.4 引物設(shè)計
        4.1.5 缺失株和互補株的構(gòu)建
        4.1.6 過表達菌株的構(gòu)建
        4.1.7 生長曲線與運動性測定
        4.1.8 生物被膜測定
        4.1.9 藥物敏感性測定
        4.1.10 血清殺菌試驗
        4.1.11 細菌競爭能力測定
        4.1.12 細胞黏附及侵襲試驗
        4.1.13 致病性測定
        4.1.14 體內(nèi)載菌量測定及體內(nèi)競爭能力測定
        4.1.15 qRT-PCR檢測基因的相對轉(zhuǎn)錄水平
        4.1.16 免疫印跡試驗
        4.1.17 啟動子活性檢測
        4.1.18 CpxR的克隆表達及純化
        4.1.19 凝膠遷移試驗(EMSA)
        4.1.20 統(tǒng)計學(xué)分析
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 cpxR基因缺失株及互補株構(gòu)建
        4.2.2 生長曲線測定
        4.2.3 運動性測定
        4.2.4 生物被膜形成能力
        4.2.5 藥物敏感性測定
        4.2.6 抗血清殺菌能力
        4.2.7 菌間競爭能力測定
        4.2.8 細胞黏附及侵襲
        4.2.9 APEC致病力測定
        4.2.10 體內(nèi)載菌量測定
        4.2.11 體內(nèi)競爭能力測定
        4.2.12 APEC中 T6SS2 的轉(zhuǎn)錄與表達
        4.2.13 hcp2B啟動子活性檢測
        4.2.14 CpxR在 hcp2B啟動區(qū)域上結(jié)合位點預(yù)測
        4.2.15 CpxR蛋白表達與純化
        4.2.16 CpxR直接與hcp2B啟動子區(qū)域結(jié)合
    4.3 討論
第五章 全文結(jié)論
參考文獻
致謝
作者簡歷



本文編號：3749535