2011-2012年肉雞和蛋雞腺胃炎發(fā)病率較高，該病在中國大部分省份均有發(fā)生和流行，給養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。加強對該病檢測方法的研究，對控制傳染性病毒性腺胃炎病的發(fā)生，保護和促進養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。自腺胃炎發(fā)生以來，關于腺胃炎的病因仍然眾說紛紜，本研究在臨床上遇到的傳染性病毒性腺胃炎病例中分離出了傳染性支氣管炎病毒（IBV）。不同發(fā)病程度的患病雞的剖檢變化不同，對于病因不詳?shù)牟《拘约膊。宄《厩趾Φ闹饕衅鞴賹τ谠摬〉念A防和治療起著至關重要的作用。因此筆者應用實時熒光定量PCR的方法對患病雞的胸腺、肺臟、心臟、腺胃、腎臟、肝臟、腦等器官中病毒的含量做定量分析并進行差異顯著性分析。 將連續(xù)盲傳八代的尿囊液進行直接血凝試驗，病毒無血凝性，用1%磷脂酶C處理后有血凝性。也通過對NDV的干擾實驗及RTPCR實驗初步鑒定該病毒為傳染性支氣管炎病毒。首先針對IBV-N基因序列設計了一對特異性引物，進行RT-PCR反應，擴增出216bp的目的片段，同時參照已往發(fā)表的文獻合成一對擴增內參基因的β-actin引物，大小為139bp。將這兩個擴增的目的片段分別與pEASY-T1Clon...

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【學位級別】：碩士

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中文摘要
Abstract
前言
    1.1 致病因素
        1.1.1 非傳染性因素
        1.1.2 傳染性因素
            1.1.2.1 國外研究進展
            1.1.2.2 國內研究進展
    1.2 與傳染性病毒性腺胃炎相關的主要病原
        1.2.1 禽網(wǎng)狀內皮增生癥病毒
        1.2.2 冠狀病毒
        1.2.3 禽呼腸孤病毒
        1.2.4 馬立克氏病毒
    1.3 流行病學
    1.4 臨床癥狀
    1.5 病理組織學變化
        1.5.1 腺胃
        1.5.2 十二指腸
        1.5.3 法氏囊
        1.5.4 腎臟
        1.5.5 胸腺
    1.6 診斷
    1.7 治療
    1.8 實時熒光定量 PCR
        1.8.1 實時熒光定量 PCR 的分類
            1.8.1.1 SYBR GreenI 熒光染料法
            1.8.1.2 TaqMan 探針法
            1.8.1.3 雙雜交探針
            1.8.1.4 分子信標
        1.8.2 實時熒光定量 PCR 的定量方法
            1.8.2.1 絕對定量
            1.8.2.2 相對定量
        1.8.3 實時熒光定量 PCR 的應用
            1.8.3.1 分子生物學應用
            1.8.3.2 遺傳學
            1.8.3.3 甲基化分析
            1.8.3.4 SNP 分析
            1.8.3.5 臨床食品及環(huán)境的應用
            1.8.3.6 腫瘤基因檢測
            1.8.3.7 產(chǎn)前診斷
        1.8.4 熒光定量 PCR 的優(yōu)點
    1.9 研究的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 毒株
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器設備
    2.2 實驗方法
        2.2.1 主要溶液及其配制
        2.2.2 病毒的分離
        2.2.3 血凝試驗(HA)
        2.2.4 雞胚半數(shù)致死量試驗
        2.2.5 病毒對 NDV 的干擾試驗
        2.2.6 石蠟切片制作方法
        2.2.7 HE 染色
        2.2.8 IBV 的引物設計及目的片段擴增
        2.2.9 重組質粒的構建
            2.2.9.1 動物組織 RNA 的提取
            2.2.9.2 反轉錄反應
            2.2.9.3 PCR 反應
            2.2.9.4 PCR 產(chǎn)物的膠回收
            2.2.9.5 PCR 產(chǎn)物與 pEASY-T1 Cloning Vector 的連接反應
            2.2.9.6 大腸桿菌感受態(tài)細胞（E.coli DH5α）的制備
            2.2.9.7 連接產(chǎn)物的轉化
            2.2.9.8 質粒 DNA 的提取
            2.2.9.9 重組質粒 DNA 的鑒定
                2.2.9.9.1 質粒酶切鑒定
                2.2.9.9.2 PCR 鑒定
            2.2.9.10 陽性克隆序列測定
        2.2.10 SYBR GreenⅠ實時熒光定量 PCR 的建立
            2.2.10.1 質粒標準品的制備及原始定量
            2.2.10.2 熒光定量 PCR 反應條件的優(yōu)化
            2.2.10.3 SYBR GreenⅠ實時熒光定量 PCR 的反應體系及程序
            2.2.10.4 標準曲線的建立
            2.2.10.5 臨床樣品檢測
                2.2.10.5.1 臨床樣品組織中 RNA 的提取
                2.2.10.5.2 反轉錄反應
                2.2.10.5.3 實時熒光定量 PCR 檢測不同器官的病毒拷貝量
3. 結果
    3.1 病毒的分離與鑒定
        3.1.1 病毒的分離與傳代
        3.1.2 血凝實驗結果
        3.1.3 雞胚半數(shù)致死量試驗結果
        3.1.4 病毒對 NDV 的干擾試驗
        3.1.5 病理組織學變化
    3.2 PCR 實驗結果
    3.3 陽性質粒測序結果
    3.4 熒光定量 PCR 反應條件的優(yōu)化
    3.5 熒光定量 PCR 檢測β-actin、N 基因標準曲線的建立
    3.6 臨床樣品的檢測結果
    3.7 SPSS 17.0 軟件 Duncan 法對各器官病毒含量進行差異顯著性分析結果
4. 討論
5 結論
參考文獻
致謝
研究生期間發(fā)表論文



本文編號：3749168