副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,HPS)是全世界養(yǎng)豬業(yè)出現(xiàn)的導致新生仔豬死亡的主要病原之一,近年來,副豬嗜血桿菌桿菌病已經(jīng)給全世界養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。HPS可作為一種常在菌定殖在豬體的上呼吸道,但是在特定條件下可以侵入機體并且導致嚴重的全身性疾病,以纖維素性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征,但是參與全身感染的毒力因子及其致病機制仍舊沒有研究清楚。 自轉(zhuǎn)運蛋白是革蘭氏陰性菌V型分泌系統(tǒng)分泌的蛋白,研究發(fā)現(xiàn)它可以抑制細胞的吞噬作用以及抵抗補體介導的殺傷,幫助菌體克服宿主的天然免疫。HPS中已發(fā)現(xiàn)與毒力相關(guān)的三聚體自轉(zhuǎn)運蛋白(VtaA),發(fā)現(xiàn)其在HPS中表現(xiàn)出多樣性,并且是很好的疫苗候選抗原。 為了研究自轉(zhuǎn)運蛋白在抵抗補體介導的殺傷即血清抗性方面可能起到的作用,本論文以副豬嗜血桿菌SH0165中發(fā)現(xiàn)的自轉(zhuǎn)運蛋白基因at2為研究對象,將at2基因進行缺失,然后利用野生菌株和基因缺失株一同進行血清殺菌試驗,來探究at2基因在HPS血清抗性中的作用。具體內(nèi)容如下： 1電轉(zhuǎn)化法篩選at2-pd基因缺失株 根據(jù)同源重組的原理將at2基因的passenger domain即at2...

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞(Abbreviation)
1 文獻綜述
    1.1 副豬嗜血桿菌研究進展
        1.1.1 副豬嗜血桿菌簡介
        1.1.2 副豬嗜血桿菌毒力因子研究進展
    1.2 自轉(zhuǎn)運蛋白研究進展
        1.2.1 自轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)構(gòu)和功能
        1.2.2 副豬嗜血桿菌的自轉(zhuǎn)運蛋白
    1.3 血清抗性研究進展
        1.3.1 血清抗性機制研究進展
        1.3.2 HPS血清抗性研究進展
2 研究目的與意義
3 材料與方法
    3.1 實驗材料
        3.1.1 菌株,質(zhì)粒載體和健康豬血清
        3.1.2 試劑和試劑盒
        3.1.3 培養(yǎng)基及抗生素的配制
        3.1.4 主要溶液的配制
        3.1.5 引物
        3.1.6 主要儀器
    3.2 試驗方法
        3.2.1 副豬嗜血桿菌的培養(yǎng)及基因組的提取
        3.2.2 基因克隆程序
        3.2.3 蛋白的原核表達、純化及SDS-PAGE檢測
        3.2.4 健康豬血清的制備
        3.2.5 電轉(zhuǎn)化法篩選at2基因缺失株
        3.2.6 結(jié)合轉(zhuǎn)移法篩選at2基因缺失株
        3.2.7 自然轉(zhuǎn)化法篩選at2基因缺失株
        3.2.8 at2基因缺失株的鑒定
        3.2.9 生長曲線繪制
        3.2.10 血清殺菌試驗
4 結(jié)果與分析
    4.1 電轉(zhuǎn)化法篩選at2-pd基因缺失株
        4.1.1 重組質(zhì)粒pSHK3^TS-at2-pd-UD的構(gòu)建
        4.1.2 重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入SH0165中
        4.1.3 用重組溫敏型質(zhì)粒篩選at2-pd基因缺失突變株
    4.2 HS1073體外加入AT2-PD蛋白進行血清殺菌試驗
        4.2.1 SH0165和HS1073的血清抗性
        4.2.2 AT2-PD蛋白的原核表達、純化及SDS-PAGE檢測
        4.2.3 確定血清的最佳殺菌濃度
        4.2.4 確定試驗用AT2-PD蛋白的最適濃度
        4.2.5 AT2-PD蛋白對HS1073菌株血清抗性有提高作用
    4.3 其他方法篩選at2基因缺失株
        4.3.1 接合轉(zhuǎn)移法篩選
        4.3.2 自然轉(zhuǎn)化法篩選
    4.4 基因缺失株的鑒定
        4.4.1 PCR鑒定
        4.4.2 缺失株at2-pd基因測序
        4.4.3 Western blot鑒定
        4.4.4 Southern blot鑒定
    4.5 生長曲線的繪制
    4.6 缺失株和野生株進行血清殺菌試驗
5 討論
    5.1 at2基因缺失株的篩選
        5.1.1 電轉(zhuǎn)化法溫敏質(zhì)粒篩選
        5.1.2 接合轉(zhuǎn)移法篩選
        5.1.3 自然轉(zhuǎn)化法篩選
    5.2 體外加入AT2-PD蛋白進行血清殺菌試驗
    5.3 缺失株和野生株進行血清殺菌試驗
6 結(jié)論
參考文獻
附錄
致謝



本文編號：3746258