發(fā)布時間：2023-02-15 14:57

　　microRNAs (miRNAs)在調(diào)控哺乳動物黑色素生成和毛色方面具有重要的作用,在不同毛色羊駝皮膚miRNA的表達(dá)譜分析中,發(fā)現(xiàn)一個新的miRNA(命名為lpa-miR-nov-66),并呈差異表達(dá)。經(jīng)預(yù)測,soluble guanylate cyclase (sGC)是lpa-miR-nov-66的靶基因之一。本實驗為了研究lpa-miR-nov-66與羊駝黑色素細(xì)胞產(chǎn)生黑色素之間的相關(guān)性,通過構(gòu)建lpa-miR-nov-66表達(dá)載體,用雙熒光報告載體驗證了lpa-miR-nov-66的靶基因(sGC)；將lpa-miR-nov-66轉(zhuǎn)染羊駝黑色素細(xì)胞,應(yīng)用實時熒光定量PCR、Western blotting、ELASA等方法對轉(zhuǎn)染后黑色素細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測,主要實驗結(jié)果如下： 1實時熒光定量PCR技術(shù)檢測sGC, MITF, TYR, TYRP1基因mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示：sGC基因在lpa-miR-nov-66轉(zhuǎn)染組中的mRNA表達(dá)水平是對照組的5.83倍,MITFmRNA在轉(zhuǎn)染組和對照組中的差異不顯著,TYR在轉(zhuǎn)染組中的mRNA表達(dá)水平是對照組的0...

【文章頁數(shù)】：55 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
前言
文獻(xiàn)綜述
    1. 黑色素細(xì)胞的發(fā)育與功能
        1.1 黑色素細(xì)胞的發(fā)育
        1.2 黑色素細(xì)胞的功能
        1.3 黑色素的合成路徑
        1.4 有關(guān)黑色素生成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
        1.5 影響色素形成的主效基因
    2 miRNAs的研究現(xiàn)狀及其在毛色中的應(yīng)用
        2.1 RNA干擾作用和miRNA的發(fā)現(xiàn)
        2.2 miRNA生物發(fā)生機(jī)制
        2.3 miRNA的功能
材料和方法
    1 實驗材料
        1.1 實驗樣本
        1.2 實驗所用儀器
        1.3 細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑與耗材
        1.4 構(gòu)建lpa-miR-nov-66過表達(dá)載體,靶基因sGC擴(kuò)增和雙熒光報告載體所需試劑和耗材
        1.5 總RNA的提取,RT-PCR,qRT-PCR所需試劑
        1.6 總蛋白的提取及免疫蛋白印跡技術(shù)所需試劑
    2 實驗方法
        2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2 lpa-miR-nov-66過表達(dá)載體質(zhì)粒的構(gòu)建,靶基因sGC的篩選以及靶基因sGC雙熒光報告載體的構(gòu)建
        2.3 雙熒光報告載體和lpa-miR-nov-66表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞檢測熒光信號
        2.4 黑色素細(xì)胞總RNA的提取
        2.5 蛋白免疫印跡實驗方法
        2.6 cAMP和cGMP含量的測定
        2.7 黑色素含量的測定
實驗結(jié)果
    1. lpa-miR-nov-66在不同毛色羊駝皮膚中的表達(dá)量
    2. sGC擴(kuò)增序列和預(yù)測位點結(jié)果
    3. lpa-miR-nov-66轉(zhuǎn)染羊駝黑色素細(xì)胞的表達(dá)量變化
        3.1 轉(zhuǎn)染lpa-miR-nov-66羊駝黑色素細(xì)胞總RNA的質(zhì)量檢測
        3.2 lpa-miR-nov-66轉(zhuǎn)染羊駝黑色素細(xì)胞后lpa-miR-nov-66表達(dá)水平
        3.3 lpa-miR-nov-66轉(zhuǎn)染羊駝黑色素細(xì)胞后sGC,MITF,TYR,TYRP1基因表達(dá)水平
    4. lpa-miR-nov-66轉(zhuǎn)染羊駝黑色素細(xì)胞后sGC,MITF,TYR和TYRP1蛋白表達(dá)水平
    5. lpa-miR-nov-66轉(zhuǎn)染羊駝黑色素細(xì)胞后黑色素含量的檢測
    6. lpa-miR-nov-66轉(zhuǎn)染羊駝黑色素細(xì)胞后對cAMP和cGMP的影響結(jié)果
    7. 雙熒光表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞驗證靶基因
討論
全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
Abstract
中英文對照表及縮寫表
致謝



本文編號：3743396