禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌(avian pathogenic Escherichia coli, APEC)引起的一種常見的局部或全身性感染的細菌性傳染病,包括大腸桿菌性肉芽腫、腹膜炎、輸卵管炎、臍炎、滑膜炎、氣囊炎、眼炎、卵黃性腹膜炎等疾病,隨著集約化養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展,給養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。 莢膜多糖是禽致病性大腸桿菌的重要的致病因了,能夠保護機體免受宿主免疫系統(tǒng)的侵害,neuC是莢膜多糖區(qū)域二的基因,neuC基因的缺失會使莢膜在合成方面產(chǎn)生缺陷。 本研究利用λ-Red同源重組的方法構(gòu)建了E058△neuC::cat、E058△neuC基因缺失突變株,同時將帶有相應(yīng)啟動子的neuC全基因和完整的“意外轉(zhuǎn)錄本”插入表達載體pGEX-6P-1中,構(gòu)建相應(yīng)的回復(fù)株。PCR擴增出帶有酶切位點的neuC基因并將其插入到pMD(?)19-Tsimple vector載體中,篩選出陽性重組子pMD-T-neuC,然后運用分子克隆方法將chlormycetin (cat)抗性基因插入到目的基因neuC中,構(gòu)建出帶有chlormycetin抗性基因質(zhì)粒pMD-neuC-Cat。PCR擴增neu...

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
符號說明
綜述
    第一部分 禽源性大腸桿菌的研究進展
        1. 大腸桿菌病概述
        2. 潛在致病因了研究
            2.1 禽大腸桿菌的優(yōu)勢血清型
            2.2 脂多糖(LPS)
            2.3 黏附素(Adhesin)
                2.3.1 Ⅰ型菌毛黏附素
                2.3.2 P型菌毛黏附素
                2.3.3 Curli菌毛黏附素
            2.4 莢膜
            2.5 溫度敏感性血凝素(temperature-sensitive hemagglutinin,Tsh)
            2.6 鐵攝取系統(tǒng)
            2.7 外膜蛋白(Outer membrane proteins,OMPs)
            2.8 侵襲素(IbeA)
        3. APEC的致病機理
    第二部分 λRed重組技術(shù)的應(yīng)用展望
        1. λRed重組系統(tǒng)的作用機制
        2. λRed重組系統(tǒng)的應(yīng)用前景展望
    參考文獻
前言
1 材料
    1.1 囷株和質(zhì)粒
    1.2 主要試劑
    1.3 主要儀器
    1.4 分子生物學(xué)及數(shù)據(jù)分析軟件
    1.5 試驗雞
2 方法
    2.1 T-neuC-Cat重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.1.1 neuC基因的擴增
        2.1.2 neuC基因的克隆
        2.1.3 將抗性基因克隆入重組質(zhì)粒
    2.2 E05SAneuC::cat突變株的構(gòu)建以及？i Red重組系統(tǒng)引入抗性的去除
        2.2.1 感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化
            2.2.1.1 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備
            2.2.1.2 質(zhì)粒pKD46的轉(zhuǎn)化
            2.2.1.3 質(zhì)粒pKD46功能的誘導(dǎo)和感受態(tài)細胞的制備
            2.2.1.4 電轉(zhuǎn)化
            2.2.1.5 質(zhì)粒pKD46的消除
        2.2.2 氯霉素抗性基因的去除
            2.2.2.1 質(zhì)粒pCP20電轉(zhuǎn)入突變株E058△neuC::cat
                2.2.2.1.1 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備
                2.2.2.1.2 質(zhì)粒pCP20的轉(zhuǎn)化
                2.2.2.1.3 質(zhì)粒pCP20的消除
    2.3 RT-PCR
        2.3.1 細菌RNA的提取
        2.3.2 DNA的去除反應(yīng)
        2.3.3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
        2.3.4 cDNA的PCR鑒定
    2.4 neuC突變株的回復(fù)拯救試驗及“意外轉(zhuǎn)錄本”的回復(fù)拯救試驗
        2.4.1 neuC完整基因片段及“意外轉(zhuǎn)錄本”的擴增
        2.4.2 重組質(zhì)粒pGEX-6p-1neuC和pGEX-6p-1 neuC'的構(gòu)建
        2.4.3 電轉(zhuǎn)化受體菌獲得回復(fù)拯救株
    2.5 突變株的生物學(xué)特性的研究
        2.5.1 細菌生長曲線的測定
        2.5.2 12日齡SPF雞胚的致死率試驗
        2.5.3 1日齡雛雞致死性試驗
        2.5.4 SPF雞血清的殺菌性實驗
        2.5.5 HD11細胞的吞噬實驗
        2.5.6 體內(nèi)分布試驗
3 結(jié)果
    3.1 neuC片段及neuC片段克隆入pMD(?)19-T載體中的鑒定
    3.2 Chloramphenicol抗性基因的獲得
    3.3 重組質(zhì)粒T-neuC-Cat的構(gòu)建
    3.4 突變株的構(gòu)建與鑒定
        3.4.1 DNA片段的準備及電轉(zhuǎn)化
        3.4.2 突變株E058△neuC::cat的PCR鑒定結(jié)果
        3.4.3 去抗性突變株E058△neuC的PCR鑒定結(jié)果
    3.5 RT-PCR結(jié)果
        3.5.1 突變株E058△neuC::cat、E058△neuC的RT-PCR鑒定結(jié)果
            3.5.1.1 突變株E058△neuC::cat的RT-PCR鑒定結(jié)果
            3.5.1.2 去抗性突變株E058△neuC的RT-PCR鑒定結(jié)果
    3.6 回復(fù)株的構(gòu)建及鑒定結(jié)果
    3.7 生長曲線結(jié)果
        3.7.1 E058及突變株E058△neuC::cat、E058△neuC的生長曲線
    3.8 SPF雞胚的致死率試驗結(jié)果
    3.9 1日齡雛雞致死性試驗
    3.10 血清殺菌試驗結(jié)果
    3.11 細胞吞噬試驗結(jié)果
    3.12 35日齡SPF雞體內(nèi)動態(tài)分布試驗結(jié)果
4 討論
全文總結(jié)
參考文獻
致謝



本文編號：3741893