腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)是單股正鏈無囊膜的小RNA病毒,人和動物感染后可引起腦炎、心肌炎以及神經系統(tǒng)疾病和生殖障礙等,是重要的人畜共患病原體,對人類健康具有重要的公共衛(wèi)生學意義。病毒入侵宿主時可通過多種方式和策略逃避宿主的天然免疫應答機制,很多病毒利用自身編碼的不同蛋白拮抗或抑制宿主天然免疫過程,從而實現病毒在宿主細胞內的有效增殖。本研究前期通過實時熒光定量PCR技術篩選了能夠顯著促進EMCV體外增殖的結構蛋白VP2,為探明VP2促進EMCV體外增殖的作用機制,進一步深入研究了VP2在IFN-β產生及RLRs信號通路中的調控作用。通過免疫印跡、免疫共沉淀及激光共聚焦等實驗篩選并驗證受VP2蛋白調控的RLRs信號通路的作用靶分子以及VP2抑制RLRs信號通路的可能作用機理。本研究獲得以下研究結果:1.EMCV結構蛋白VP1、VP2和VP3均可顯著促進EMCV體外增殖,其中VP2蛋白對病毒的增殖效果最明顯。此外,VP2促進EMCV體外增殖與RLRs信號通路活化和IFN-β產生密切相關。2.結構蛋白VP2以劑量依賴方式顯著抑制EMCV、P...

【文章頁數】：89 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
項目資金來源
摘要
Abstract
縮略詞英文對照表
第一章 腦心肌炎病毒和病毒蛋白參與免疫應答的研究進展
    1 腦心肌炎病毒
        1.1 EMCV的來歷和分類
        1.2 EMCV病毒特征和基因組結構
        1.3 EMCV病毒蛋白
        1.4 EMCV病毒衣殼的三維結構
        1.5 EMCV病毒周期
            1.5.1 病毒吸附和進入
            1.5.2 病毒翻譯
            1.5.3 EMCV病毒多聚蛋白裂解
            1.5.4 EMCV病毒復制
            1.5.5 EMCV病毒組裝和釋放
    2 抗病毒信號轉導途徑及EMCV免疫學研究
        2.1 RLRs/MAVS信號途徑
        2.2 JAK/STATs信號途徑
        2.3 EMCV免疫逃逸機制
    3 本研究的目的和意義
第二章 EMCV VP2 蛋白對病毒體外增殖的作用研究
    1 實驗材料
        1.1 細胞、質粒和病毒
        1.2 主要試劑
        1.3 主要試劑的配制
        1.4 主要儀器設備
    2 實驗方法
        2.1 細胞復蘇與培養(yǎng)
        2.2 EMCV培養(yǎng)與擴增
        2.3 HEK293細胞瞬時轉染及EMCV感染
        2.4 EMCV結構蛋白VP1、VP2和VP3真核表達載體構建
            2.4.1 EMCV病毒RNA提取
            2.4.2 EMCV病毒RNA反轉錄cDNA
            2.4.3 EMCV VP1、VP2和VP3基因PCR擴增
            2.4.4 VP1、VP2和VP3重組質粒構建及雙酶切驗證
            2.4.5 VP1、VP2和VP3重組表達質粒提取及其在HEK293細胞中的表達
        2.5 VP2對細胞的毒性實驗檢測
        2.6 實時熒光定量PCR檢測EMCV拷貝數
        2.7 TCID50檢測EMCV毒價
        2.8 ELISA檢測VP2對IFN-β表達的影響
        2.9 VP2對EMCV介導的IFN-β及JAK/ STAT通路相關因子轉錄的影響
            2.9.1 qPCR檢測EMCV感染HEK293細胞中IFN-βmRNA
            2.9.2 qPCR檢測IFN-β及JAK/ STAT通路相關因子mRNA表達
        2.10 VP2蛋白對RLRs通路相關因子表達的影響
        2.11 統(tǒng)計學分析
    3 實驗結果
        3.1 EMCV結構蛋白真核表達載體構建及驗證
        3.2 EMCV結構蛋白促進病毒體外增殖
        3.3 VP2抑制EMCV誘導的IFN-β產生及JAK/STAT信號通路下游因子轉錄
        3.4 EMCV VP2抑制病毒誘導的RLRs信號通路蛋白表達
    4 小結
第三章 EMCV VP2 蛋白對RLRs信號通路的調控作用研究
    1 實驗材料
        1.1 細胞、質粒和病毒
        1.2 主要試劑
        1.3 主要試劑的配制
        1.4 主要儀器設備
    2 實驗方法
        2.1 EMCV VP2對Poly(I:C)介導的RLRs通路相關因子表達的影響
            2.1.1 細胞培養(yǎng)與轉染
            2.1.2 細胞總RNA提取及反轉錄cDNA
            2.1.3 qPCR檢測IFN-β及RLRs通路相關因子mRNA
            2.1.4 ELISA檢測HEK293細胞中IFN-β表達
        2.2 EMCV VP2對Poly(I:C)誘導的IRF3和STAT1磷酸化和核轉移的影響
        2.3 EMCV VP2對外源MDA5、MAVS、TBK1和IRF3誘導IFN-β轉錄和表達的影響
        2.4 EMCV VP2對MDA5、MAVS、TBK1和IRF3誘導RLRs通路關鍵蛋白表達的影響
        2.5 統(tǒng)計學分析
    3 實驗結果
        3.1 EMCV VP2抑制Poly(I:C)誘導的RLRs信號通路相關因子mRNA
        3.2 EMCV VP2抑制Poly(I:C)誘導的信號通路中IRF3和STAT1的磷酸化
        3.3 EMCV VP2抑制RLRs通路關鍵蛋白誘導的IFN-β轉錄和表達
        3.4 EMCV VP2抑制RLRs通路關鍵蛋白誘導的RLRs蛋白的表達
    4 小結與討論
第四章 EMCV VP2蛋白與RLRs信號通路關鍵蛋白的相互作用研究
    1 實驗材料
        1.1 細胞及質粒
        1.2 主要試劑
        1.3 主要試劑的配制
        1.4 主要儀器設備
    2 實驗方法
        2.1 激光共聚焦顯微鏡觀察VP2蛋白與RLRs信號通路關鍵蛋白的共定位分析
            2.1.1 細胞培養(yǎng)與轉染
            2.1.2 IFA實驗及激光共聚焦顯微鏡觀察照像
        2.2 免疫共沉淀Co-IP檢測VP2蛋白與RLRs信號通路關鍵蛋白的相互作用
            2.2.1 細胞培養(yǎng)與轉染
            2.2.2 Co-IP實驗
        2.3 蛋白酶體途徑抑制劑MG132處理對VP2抑制RLRs信號通路關鍵蛋白的影響
    3.實驗結果
        3.1 激光共聚焦驗證VP2蛋白與MDA5、MAVS、TBK1和IFR3蛋白共定位
        3.2 Co-IP驗證VP2蛋白與MDA5、MAVS和TBK1蛋白相互作用
        3.3 VP2通過蛋白酶體途徑抑制RLRs信號通路關鍵蛋白的表達
    4 小結與討論
第五章 全文總結
參考文獻
致謝
附錄
    作者簡介
    碩士期間主持的科研項目
    碩士期間發(fā)表的論文



本文編號：3740139