腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)是單股正鏈無囊膜的小RNA病毒,人和動物感染后可引起腦炎、心肌炎以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病和生殖障礙等,是重要的人畜共患病原體,對人類健康具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。病毒入侵宿主時可通過多種方式和策略逃避宿主的天然免疫應(yīng)答機制,很多病毒利用自身編碼的不同蛋白拮抗或抑制宿主天然免疫過程,從而實現(xiàn)病毒在宿主細胞內(nèi)的有效增殖。本研究前期通過實時熒光定量PCR技術(shù)篩選了能夠顯著促進EMCV體外增殖的結(jié)構(gòu)蛋白VP2,為探明VP2促進EMCV體外增殖的作用機制,進一步深入研究了VP2在IFN-β產(chǎn)生及RLRs信號通路中的調(diào)控作用。通過免疫印跡、免疫共沉淀及激光共聚焦等實驗篩選并驗證受VP2蛋白調(diào)控的RLRs信號通路的作用靶分子以及VP2抑制RLRs信號通路的可能作用機理。本研究獲得以下研究結(jié)果:1.EMCV結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2和VP3均可顯著促進EMCV體外增殖,其中VP2蛋白對病毒的增殖效果最明顯。此外,VP2促進EMCV體外增殖與RLRs信號通路活化和IFN-β產(chǎn)生密切相關(guān)。2.結(jié)構(gòu)蛋白VP2以劑量依賴方式顯著抑制EMCV、P...

【文章頁數(shù)】：89 頁

【學(xué)位級別】：碩士

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摘要
Abstract
縮略詞英文對照表
第一章 腦心肌炎病毒和病毒蛋白參與免疫應(yīng)答的研究進展
    1 腦心肌炎病毒
        1.1 EMCV的來歷和分類
        1.2 EMCV病毒特征和基因組結(jié)構(gòu)
        1.3 EMCV病毒蛋白
        1.4 EMCV病毒衣殼的三維結(jié)構(gòu)
        1.5 EMCV病毒周期
            1.5.1 病毒吸附和進入
            1.5.2 病毒翻譯
            1.5.3 EMCV病毒多聚蛋白裂解
            1.5.4 EMCV病毒復(fù)制
            1.5.5 EMCV病毒組裝和釋放
    2 抗病毒信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及EMCV免疫學(xué)研究
        2.1 RLRs/MAVS信號途徑
        2.2 JAK/STATs信號途徑
        2.3 EMCV免疫逃逸機制
    3 本研究的目的和意義
第二章 EMCV VP2 蛋白對病毒體外增殖的作用研究
    1 實驗材料
        1.1 細胞、質(zhì)粒和病毒
        1.2 主要試劑
        1.3 主要試劑的配制
        1.4 主要儀器設(shè)備
    2 實驗方法
        2.1 細胞復(fù)蘇與培養(yǎng)
        2.2 EMCV培養(yǎng)與擴增
        2.3 HEK293細胞瞬時轉(zhuǎn)染及EMCV感染
        2.4 EMCV結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2和VP3真核表達載體構(gòu)建
            2.4.1 EMCV病毒RNA提取
            2.4.2 EMCV病毒RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA
            2.4.3 EMCV VP1、VP2和VP3基因PCR擴增
            2.4.4 VP1、VP2和VP3重組質(zhì)粒構(gòu)建及雙酶切驗證
            2.4.5 VP1、VP2和VP3重組表達質(zhì)粒提取及其在HEK293細胞中的表達
        2.5 VP2對細胞的毒性實驗檢測
        2.6 實時熒光定量PCR檢測EMCV拷貝數(shù)
        2.7 TCID50檢測EMCV毒價
        2.8 ELISA檢測VP2對IFN-β表達的影響
        2.9 VP2對EMCV介導(dǎo)的IFN-β及JAK/ STAT通路相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄的影響
            2.9.1 qPCR檢測EMCV感染HEK293細胞中IFN-βmRNA
            2.9.2 qPCR檢測IFN-β及JAK/ STAT通路相關(guān)因子mRNA表達
        2.10 VP2蛋白對RLRs通路相關(guān)因子表達的影響
        2.11 統(tǒng)計學(xué)分析
    3 實驗結(jié)果
        3.1 EMCV結(jié)構(gòu)蛋白真核表達載體構(gòu)建及驗證
        3.2 EMCV結(jié)構(gòu)蛋白促進病毒體外增殖
        3.3 VP2抑制EMCV誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生及JAK/STAT信號通路下游因子轉(zhuǎn)錄
        3.4 EMCV VP2抑制病毒誘導(dǎo)的RLRs信號通路蛋白表達
    4 小結(jié)
第三章 EMCV VP2 蛋白對RLRs信號通路的調(diào)控作用研究
    1 實驗材料
        1.1 細胞、質(zhì)粒和病毒
        1.2 主要試劑
        1.3 主要試劑的配制
        1.4 主要儀器設(shè)備
    2 實驗方法
        2.1 EMCV VP2對Poly(I:C)介導(dǎo)的RLRs通路相關(guān)因子表達的影響
            2.1.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
            2.1.2 細胞總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄cDNA
            2.1.3 qPCR檢測IFN-β及RLRs通路相關(guān)因子mRNA
            2.1.4 ELISA檢測HEK293細胞中IFN-β表達
        2.2 EMCV VP2對Poly(I:C)誘導(dǎo)的IRF3和STAT1磷酸化和核轉(zhuǎn)移的影響
        2.3 EMCV VP2對外源MDA5、MAVS、TBK1和IRF3誘導(dǎo)IFN-β轉(zhuǎn)錄和表達的影響
        2.4 EMCV VP2對MDA5、MAVS、TBK1和IRF3誘導(dǎo)RLRs通路關(guān)鍵蛋白表達的影響
        2.5 統(tǒng)計學(xué)分析
    3 實驗結(jié)果
        3.1 EMCV VP2抑制Poly(I:C)誘導(dǎo)的RLRs信號通路相關(guān)因子mRNA
        3.2 EMCV VP2抑制Poly(I:C)誘導(dǎo)的信號通路中IRF3和STAT1的磷酸化
        3.3 EMCV VP2抑制RLRs通路關(guān)鍵蛋白誘導(dǎo)的IFN-β轉(zhuǎn)錄和表達
        3.4 EMCV VP2抑制RLRs通路關(guān)鍵蛋白誘導(dǎo)的RLRs蛋白的表達
    4 小結(jié)與討論
第四章 EMCV VP2蛋白與RLRs信號通路關(guān)鍵蛋白的相互作用研究
    1 實驗材料
        1.1 細胞及質(zhì)粒
        1.2 主要試劑
        1.3 主要試劑的配制
        1.4 主要儀器設(shè)備
    2 實驗方法
        2.1 激光共聚焦顯微鏡觀察VP2蛋白與RLRs信號通路關(guān)鍵蛋白的共定位分析
            2.1.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
            2.1.2 IFA實驗及激光共聚焦顯微鏡觀察照像
        2.2 免疫共沉淀Co-IP檢測VP2蛋白與RLRs信號通路關(guān)鍵蛋白的相互作用
            2.2.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
            2.2.2 Co-IP實驗
        2.3 蛋白酶體途徑抑制劑MG132處理對VP2抑制RLRs信號通路關(guān)鍵蛋白的影響
    3.實驗結(jié)果
        3.1 激光共聚焦驗證VP2蛋白與MDA5、MAVS、TBK1和IFR3蛋白共定位
        3.2 Co-IP驗證VP2蛋白與MDA5、MAVS和TBK1蛋白相互作用
        3.3 VP2通過蛋白酶體途徑抑制RLRs信號通路關(guān)鍵蛋白的表達
    4 小結(jié)與討論
第五章 全文總結(jié)
參考文獻
致謝
附錄
    作者簡介
    碩士期間主持的科研項目
    碩士期間發(fā)表的論文



本文編號：3740139