豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的一種以脫水、腹瀉、腸絨毛嚴(yán)重萎縮為主要病變的傳染病。2010年以來(lái),PEDV變異株在世界多國(guó)豬場(chǎng)相繼暴發(fā)流行,其對(duì)哺乳仔豬致病性強(qiáng)、死亡率高,一周齡以下的仔豬感染后其致死率可高達(dá)100%。該P(yáng)EDV變異株的出現(xiàn)在我國(guó)及全球造成重大經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展,開發(fā)用于檢測(cè)PEDV感染的制劑和相應(yīng)方法顯得尤為重要且緊迫。核衣殼蛋白(N)在不同的PEDV毒株間高度保守、且在宿主感染早期合成,因此,PEDV N蛋白是作為感染早期檢測(cè)的理想靶標(biāo)。為有助于開發(fā)一系列檢測(cè)PEDV感染的方法,本研究制備了抗PEDV N蛋白的單克隆抗體,并測(cè)試了其在不同檢測(cè)方法中的應(yīng)用前景。首先,本研究從PEDV LJX/2014毒株中采用RT-PCR方法擴(kuò)增獲得了N基因,隨后將其因克隆至pET-30a(+)原核表達(dá)載體,獲得了表達(dá)PEDV N蛋白的重組表達(dá)質(zhì)粒,并將其命名為pET-N。將pET-N轉(zhuǎn)化至BL-21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中表達(dá)N蛋白,結(jié)果表明,該目標(biāo)蛋白以分泌型及包涵體形式同時(shí)表達(dá)。經(jīng)優(yōu)化表達(dá)條件,最終獲得大量分泌型表達(dá)的N蛋白。采用鎳柱親和層析...

【文章頁(yè)數(shù)】：52 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 冠狀病毒
    1.2 常見(jiàn)的豬冠狀病毒
    1.3 豬流行性腹瀉(PEDV)及N蛋白
        1.3.1 PEDV的發(fā)展及流行
        1.3.2 PEDV的結(jié)構(gòu)組成及功能
    1.4 抗體
    1.5 單克隆抗體
    1.6 研究目的與意義
第二章 PEDV N蛋白的基因克隆、表達(dá)及純化
    2.1 材料
        2.1.1 病毒株、菌株、細(xì)胞株和質(zhì)粒
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器設(shè)備
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 PEDV N蛋白的基因擴(kuò)增
            2.2.1.1 PEDV的 RNA提取
            2.2.1.2 PEDV N蛋白基因的擴(kuò)增
        2.2.2 重組質(zhì)粒pET-N的構(gòu)建
            2.2.2.1 限制性內(nèi)切酶酶切實(shí)驗(yàn)
            2.2.2.2 重組質(zhì)粒的連接
            2.2.2.3 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            2.2.2.4 重組質(zhì)粒的提取
        2.2.3 質(zhì)粒pET-N陽(yáng)性克隆的鑒定
            2.2.3.1 質(zhì)粒pET-N的雙酶切鑒定
            2.2.3.2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定
            2.2.3.3 重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定
        2.2.4 PEDV N蛋白的表達(dá)、鑒定及純化
            2.2.4.1 PEDV N蛋白的表達(dá)
            2.2.4.2 PEDV N蛋白的SDS-PAGE及 Western blotting分析鑒定
            2.2.4.3 PEDV N蛋白的純化
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 PEDV N基因的克隆
        2.3.2 PEDV N蛋白的表達(dá)
        2.3.3 PEDV N蛋白的純化
    2.4 討論
第三章 抗PEDV N蛋白的mAbs的制備及驗(yàn)證
    3.1 材料
        3.1.1 病毒株、菌株、細(xì)胞株和質(zhì)粒
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器設(shè)備
        3.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 小鼠免疫
            3.2.1.1 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)
        3.2.2 雜交瘤細(xì)胞的制備
        3.2.3 篩選雜交瘤細(xì)胞篩選及鑒定
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 抗PEDV N蛋白mAbs的制備
        3.3.2 抗PEDV N蛋白mAbs的亞類鑒定
        3.3.3 抗PEDV N蛋白mAbs的腹水效價(jià)測(cè)定
        3.3.4 單克隆抗體5F3 的親和性
    3.4 討論
第四章 抗PEDV N蛋白的mAbs的功能驗(yàn)證
    4.1 材料
        4.1.1 病毒株、菌株、細(xì)胞株和質(zhì)粒
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要儀器設(shè)備
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 間接免疫熒光(IFA)
        4.2.2 流式細(xì)胞術(shù)
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 抗PEDV N蛋白mAbs的 ELISA反應(yīng)性檢測(cè)
        4.3.2 抗PEDV N蛋白mAbs的 Western blotting反應(yīng)性檢測(cè)
        4.3.3 抗PEDV N蛋白mAbs的 IFA反應(yīng)性檢測(cè)
        4.3.4 抗PEDV N蛋白mAbs的流式細(xì)胞術(shù)反應(yīng)性檢測(cè)
        4.3.5 單克隆抗體5F3 的親和性檢測(cè)
    4.4 討論
第五章 抗PEDV N蛋白的mAbs的抗原表位鑒定
    5.1 材料
        5.1.1 病毒株、菌株、細(xì)胞株和質(zhì)粒
        5.1.2 主要試劑
        5.1.3 主要儀器設(shè)備
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 PEDV N蛋白截短肽的表達(dá)
        5.2.2 PEDV N蛋白截短肽的合成
    5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.3.1 PEDV N蛋白截短肽的表達(dá)
        5.3.2 PEDV N蛋白截短肽的驗(yàn)證
        5.3.3 mAb精細(xì)表位的鑒定
    5.4 討論
第六章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3738573