TGF-β超家族作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞外配體調(diào)節(jié)細胞的分化、凋亡和增殖,在生殖細胞發(fā)育調(diào)控中起重要作用。GDF9屬于TGF-p超家族成員,在人、羊、鼠卵泡發(fā)育和排卵過程中發(fā)揮重要作用；此外,在鼠、貓、羊駝等動物睪丸中檢測到了GDF9及其受體的表達。體外研究發(fā)現(xiàn),GDF9通過影響與鼠睪丸支持細胞緊密連接相關(guān)蛋白的表達與定位,可影響支持細胞間緊密連接功能。然而,GDF9及其受體在牛睪丸中的表達分布,以及GDF9是否參與牛支持細胞、腔前卵泡和胚胎發(fā)育的調(diào)節(jié)研究報道較少�；诖�,本研究從基因多態(tài)性著手,分析牛GDF9基因多態(tài)性與超數(shù)排卵效果、胚胎移植妊娠率以及精液品質(zhì)的關(guān)系；其次探討GDF9對牛腔前卵泡生長發(fā)育與存活的作用;再者通過鑒定GDF9及其受體BMPRII和ALK5在牛睪丸的表達與分布,研究GDF9對牛睪丸支持細胞增殖與凋亡以及支持細胞緊密連接能力的作用,以探討GDF9對牛卵泡發(fā)育和精子發(fā)生及胚胎發(fā)育的作用及其機制。具體內(nèi)容如下：1、牛GDF9基因多態(tài)性對超數(shù)排卵效果、胚胎移植妊娠率以及精液品質(zhì)的影響利用候選基因法,采用PCR-SSCP、PCR-RFLP和測序等技術(shù),研究了GDF9基因在中...

【文章頁數(shù)】：123 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第一部分 文獻綜述
    1 GDF9研究進展
        1.1 GDF9基本結(jié)構(gòu)
        1.2 GDF9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
        1.3 GDF9對卵泡發(fā)育的調(diào)控
            1.3.1 生長因子對卵泡發(fā)育的調(diào)控作用
            1.3.2 GDF9對卵泡發(fā)育的影響
        1.4 GDF9對睪丸發(fā)育和精子發(fā)生的影響
    2 腔前卵泡體外培養(yǎng)研究進展
        2.1 卵泡生長發(fā)育的一般規(guī)律和調(diào)控模式
        2.2 體外腔前卵泡培養(yǎng)研究進展
    3 睪丸支持細胞與精子發(fā)生
        3.1 精子發(fā)生的過程及基因表達調(diào)控
        3.2 睪丸支持細胞在精子發(fā)生中的作用
    4 研究目的與意義
第二部分 試驗研究
    實驗一 牛GDF9基因多態(tài)性及其與超數(shù)排卵效果的關(guān)系
        1 引言
        2 材料與方法
            2.1 實驗材料
                2.1.1 實驗動物
                2.1.2 試驗樣品的采集
                2.1.3 主要儀器設(shè)備
                2.1.4 主要酶、試劑和試劑盒
                2.1.5 主要溶液的配置
            2.2 研究方法
                2.2.1 中國荷斯坦奶牛超數(shù)排卵處理程序
                2.2.2 沖胚及數(shù)據(jù)收集
                2.2.3 �；蚪MDNA的提取及檢測
                2.2.4 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測
                2.2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染檢測
                2.2.6 PCR-SSCP檢測
                2.2.7 目的片段回收純化
                2.2.8 引物設(shè)計及PCR反應(yīng)條件
                2.2.9 酶切位點的引入與基因分型
            2.3 統(tǒng)計分析
        3 結(jié)果
            3.1 基因組DNA提取物
            3.2 GDF9基因PCR擴增產(chǎn)物
            3.3 GDF9基因SSCP多態(tài)性
            3.4 GDF9基因RFLP多態(tài)性
            3.5 GDF9基因型頻率和等位基因頻率
            3.6 GDF9基因多態(tài)性與奶牛超數(shù)排卵效果的關(guān)系
        4 討論
            4.1 GDF9基因突變對超數(shù)排卵的影響
            4.2 GDF9基因突變影響超數(shù)排卵的機制解析
        5 小結(jié)
    實驗二：牛GDF9基因多態(tài)性及其與胚胎移植妊娠率的關(guān)系
        1 引言
        2 材料與方法
            2.1 材料
                2.1.1 試驗動物
                2.1.2 試驗樣品的采集
            2.2 方法
                2.2.1 受體牛同期發(fā)情處理
                2.2.2 胚胎移植及妊娠檢查
                2.2.3 基因組DNA提取
                2.2.4 GDF9基因多態(tài)性檢測
                2.2.5 血清激素濃度的測定
                2.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計
        3 結(jié)果
            3.1 GDF9基因PCR擴增產(chǎn)物
            3.2 GDF9基因多態(tài)性
            3.3 GDF9基因型頻率和等位基因頻率
            3.4 GDF9基因多態(tài)性與冷凍胚胎移植妊娠率的關(guān)系
            3.5 GDF9基因多態(tài)性與胚胎移植時受體血清激素的關(guān)系
        4 討論
            4.1 GDF9基因在魯西黃牛群體中具有多態(tài)性
            4.2 GDF9基因突變與胚胎移植妊娠率關(guān)系不大
        5 小結(jié)
    實驗三：外源GDF9對牛腔前卵泡體外培養(yǎng)效果的影響
        1 引言
        2 材料與方法
            2.1 材料
                2.1.1 實驗材料及儀器設(shè)備
                2.1.2 主要試劑
                2.1.3 主要溶液配制
            2.2 方法
                2.2.1 卵巢皮質(zhì)的獲得
                2.2.2 試驗設(shè)計與培養(yǎng)條件
                2.2.3 組織學(xué)檢測
                2.2.4 TUNEL檢測
                2.2.5 統(tǒng)計分析
        3 結(jié)果
            3.1 腔前卵泡活力
            3.2 原始卵泡的激活和生長
            3.3 腔前卵泡生長
        4 討論
        5 小結(jié)
    實驗四：牛GDF9基因多態(tài)性及其與精液品質(zhì)的關(guān)系
        1 引言
        2 材料與方法
            2.1 試驗動物與數(shù)據(jù)收集
            2.2 試驗方法
                2.2.1 牛凍精基因組DNA提取
                2.2.2 GDF9基因多態(tài)性檢測
                2.2.3 統(tǒng)計分析
        3 結(jié)果
            3.1 GDF9基因PCR擴增產(chǎn)物
            3.2 GDF9基因多態(tài)性
            3.3 GDF9基因型頻率和等位基因頻率
            3.4 GDF9基因多態(tài)性與荷斯坦種公牛精液品質(zhì)的關(guān)系
        4 討論
        5 小結(jié)
    實驗五：GDF9及其受體在牛睪丸、睪丸支持細胞中的鑒定
        1 引言
        2 材料與方法
            2.1 材料
                2.1.1 實驗材料
                2.1.2 主要儀器設(shè)備
                2.1.3 主要試劑及試劑盒
            2.2 實驗方法
                2.2.1 牛睪丸支持細胞的分離與培養(yǎng)
                2.2.2 牛睪丸組織與支持細胞總RNA提取及檢測
                2.2.3 cDNA第一鏈合成
                2.2.4 PCR反應(yīng)程序和產(chǎn)物檢測
                2.2.5 蛋白的提取及Western blot檢測
                2.2.6 免疫組織化學(xué)染色
        3 結(jié)果
            3.1 牛睪丸組織和支持細胞中提取總RNA質(zhì)量檢測
            3.2 GDF9及其受體在牛睪丸支持細胞中的表達
            3.3 GDF9及其受體在牛睪丸組織中的表達
            3.4 GDF9蛋白在牛睪丸組織和支持細胞中的表達與分布
        4 討論
        5 小結(jié)
    實驗六：外源GDF9對牛睪丸支持細胞發(fā)育和功能的影響
        1 引言
        2 材料與方法
            2.1 材料
                2.1.1 實驗材料
                2.1.2 主要儀器設(shè)備
                2.1.3 主要試劑及配置
            2.2 實驗方法
                2.2.1 牛睪丸支持細胞的分離與培養(yǎng)
                2.2.2 外源GDF9的處理
                2.2.3 牛支持細胞總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄
                2.2.4 細胞周期檢測
                2.2.5 細胞凋亡檢測
                2.2.6 細胞增殖檢測
                2.2.7 跨膜電阻值測定
                2.2.8 實時熒光定量PCR
                2.2.9 統(tǒng)計分析
        3 結(jié)果
            3.1 GDF9影響牛支持細胞周期
            3.2 GDF9促進牛支持細胞增殖
            3.3 GDF9抑制牛支持細胞凋亡
            3.5 GDF9對牛occludin和claudin-11 mRNA表達的影響
            3.6 GDF9對牛支持細胞緊密連接能力的影響
        4 討論
        5 小結(jié)
第三部分 全文結(jié)論
第四部分 創(chuàng)新點和不足
    本研究的創(chuàng)新之處
    本研究的不足之處
參考文獻
發(fā)表的主要論文
致謝



本文編號：3737467