小反芻獸疫（peste des petits ruminants,PPR）是由副粘病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒屬（Morbillivirus）小反芻獸疫病毒（peste des petits ruminants virus,PPRV）感染小反芻動物而引起的一種急性傳染病,臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、口炎、腹瀉和肺炎等特征,發(fā)病過程以高發(fā)病率和高死亡率為特征。我國西藏阿里地區(qū)于2007年首次暴發(fā),近兩年,新疆、內(nèi)蒙古自治區(qū)、遼寧、山東、湖南、安徽、廣西、云南、貴州等地相繼發(fā)生疫情,小反芻獸疫防控任務十分嚴峻,有效防控小反芻獸疫的相關生物制品的研發(fā)勢在必行。但截至目前,PPRV的致病機制還有待于進一步研究。因此,建立PPRV的反向遺傳學技術操作平臺就顯得十分重要。國內(nèi)外學者為深入了解本病的發(fā)病機理,為新型載體疫苗的研制提供基礎,開展了PPRV感染性克隆的相關研究工作。本研究結合當前副黏病毒科病毒感染性克隆和麻疹病毒感染性克隆的研究方法的基礎上,通過對pBluescript?II KS（+）載體和pVAX1載體的改造,獲得可作為通用型負鏈不分節(jié)段RNA病毒的反向遺傳載體,pBKS-H... 

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略表
第一章 綜述
    1.1 麻疹病毒屬反向遺傳研究進展
        1.1.1 麻疹病毒的感染性克隆
        1.1.2 牛瘟病毒的感染性克隆
        1.1.3 犬瘟熱病毒的感染性克隆
        1.1.4 小反芻獸疫病毒的感染性克隆
    1.2 反向遺傳操作系統(tǒng)
        1.2.1 基于T7 RNA聚合酶的反向遺傳操作系統(tǒng)
        1.2.2 基于RNA聚合酶II的反向遺傳操作系統(tǒng)
    1.3 麻疹病毒屬重要受體
        1.3.1 CD150/Signaling Lymphocyte Activation Molecule (SLAM)
        1.3.2 Nectin 4/Poliovirus receptor-related 4(PVRL4)
        1.3.3 CD46/Membrane Cofactor Protein (MCP)
        1.3.4 CD209/Dendritic Cell-Specific Intracellular Adhesion Molecule3-Grabbing Nonintegrin (DC-SIGN)
        1.3.5 CD147/Extracellular Matrix Metalloproteinase Inducer (EMMPRIN)
        1.3.6 Neurokinin-1 (NK-1)
    1.4 研究目的及意義
第二章 小反芻獸疫病毒全長基因組及微基因組的構建
    2.1 材料
        2.1.1 病毒、菌種和細胞
        2.1.2 載體與主要試劑
    2.2 方法
        2.2.1 引物設計
        2.2.2 PPRV TCID50的測定
        2.2.3 PPRV cDNA的制備
        2.2.4 目的基因的RT-PCR擴增及鑒定
        2.2.5 構建帶有核酶的載體
        2.2.6 全長cDNA的連接
        2.2.7 輔助質(zhì)粒的構建及酶切鑒定
        2.2.8 輔助質(zhì)粒的活性鑒定
        2.2.9 微基因組的構建及鑒定
    2.3 結果
        2.3.1 TCID50的測定
        2.3.2 RT-PCR擴增結果
        2.3.3 陽性質(zhì)粒的鑒定結果
        2.3.4 F1F2片段的連接及鑒定
        2.3.5 F3F4片段的連接及鑒定
        2.3.6 F5F6F7片段的連接及鑒定
        2.3.7 全長的連接及鑒定
        2.3.8 全長測序結果
        2.3.9 輔助性質(zhì)粒的構建方法
        2.3.10 輔助性質(zhì)粒的鑒定
        2.3.11 輔助性質(zhì)粒的活性鑒定結果
        2.3.12 微基因組的構建方法
        2.3.13 微基因組的鑒定
        2.3.14 PPRV微基因組的拯救
    2.4 討論
第三章 山羊SLAM受體細胞系的構建及鑒定
    3.1 材料
        3.1.1 病毒、菌種和細胞
        3.1.2 載體與主要試劑
    3.2 方法
        3.2.1 SLAM基因的擴增及鑒定
        3.2.2 SLAM基因的氨基酸分析
        3.2.3 SLAM基因穩(wěn)轉細胞制備及鑒定
    3.3 結果
        3.3.1 PCR擴增結果
        3.3.2 酶切鑒定結果
        3.3.3 SLAM基因的氨基酸分析結果
        3.3.4 p Display-SLAM的酶切鑒定
        3.3.5 RT-PCR的鑒定
        3.3.6 Western Blot鑒定
        3.3.7 穩(wěn)轉細胞系的接毒實驗
    3.4 討論
第四章 H蛋白與SLAM受體相互作用的研究
    4.1 材料
        4.1.1 病毒、菌種和細胞
        4.1.2 載體與主要試劑
    4.2 方法
        4.2.1 PPRV H蛋白分析
        4.2.2 H與SLAM受體相互作用預測
        4.2.3 H蛋白胞外區(qū)的表達及分段表達
        4.2.4 SLAM基因的表達
        4.2.5 PPRV Nigeria 75/1 克隆株H蛋白與山羊SLAM受體相互作用
    4.3 結果
        4.3.1 PPRV H蛋白分析結果
        4.3.2 H蛋白與SLAM受體蛋白模型預測結果
        4.3.3 PPRV Nigeria 75/1 克隆株、PPRV Nigeria 75/1 疫苗株的H蛋白與不同SLAM受體相互作用預測結果
        4.3.4 Tibet 07 株H蛋白不同SLAM相互作用預測結果
        4.3.5 PPRV Nigeria 75/1 克隆株和Tibet 07 株H基因的擴增及鑒定結果
        4.3.6 山羊SLAM受體胞外區(qū)的擴增及鑒定結果
        4.3.7 PPRV Nigeria 75/1 克隆株H蛋白與山羊SLAM受體相互作用結果
    4.4 討論
第五章 全文結論
參考文獻
致謝
作者簡歷



本文編號：3737191