牛冠狀病毒（Bovine Coronavirus,BCoV）主要引起新生犢牛腹瀉、成年牛冬季腹瀉和牛呼吸道疾病,在全球范圍內(nèi)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。血清流行病學資料顯示國內(nèi)BCoV陽性率高且分布廣泛,但關于BCoV的病原流行病學資料欠缺。本研究的目的是開展國內(nèi)部分地區(qū)奶牛BCoV分子檢測及基因組研究,同時研制基于重組N蛋白間接ELISA抗體檢測試劑盒,取得如下成果:1.國內(nèi)部分省區(qū)奶牛冠狀病毒的分子檢測2017年9月到2018年5月,采集了6省14個奶牛場的190份犢牛腹瀉糞便樣本,采用特異性RT-PCR方法檢測BCoV的陽性率,并選取代表性樣本同時克隆纖突蛋白（S）、血凝素/酯酶蛋白（HE）、核衣殼蛋白（N）和跨膜蛋白（M）的完整基因,分析其分子特征。結(jié)果表明,BCoV的檢測率為18.95%,場陽性率為92.86%（13/14）,表明BCoV在采樣省區(qū)的奶牛中廣泛流行;從4個省8個牛場的13個陽性樣本中同時成功擴增出完整的S、HE、N和M基因,與GenBank中的全部163條完整BCoV S基因相比,本實驗克隆的12條序列和中國其它13個毒株（12株牦牛和1株奶牛）在進化樹上聚為獨立一... 

【文章頁數(shù)】：94 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 牛冠狀病毒流行特征及其S和HE基因的研究進展
    1 牛冠狀病毒的流行情況
        1.1 牛冠狀病毒引起的新生犢牛腹瀉
        1.2 牛冠狀病毒引起的成年牛冬痢疾
        1.3 牛冠狀病毒引起的牛呼吸道疾病
        1.4 牛冠狀病毒國內(nèi)外的流行情況
        1.5 牛冠狀病毒跨中間傳播
    2 牛冠狀病毒S蛋白的研究進展
        2.1 牛冠狀病毒S蛋白的分子特征
        2.2 牛冠狀病毒S蛋白的功能
    3 牛冠狀病毒HE蛋白的研究進展
        3.1 牛冠狀病毒HE蛋白的起源
        3.2 牛冠狀病毒HE蛋白的分子特征
        3.3 牛冠狀病毒HE蛋白功能
    4 小結(jié)
第二章 國內(nèi)部分省區(qū)奶牛冠狀病毒分子檢測
    1 材料與方法
        1.1 臨床樣本
        1.2 試驗儀器
        1.3 主要試劑
        1.4 引物的設計與合成
        1.5 RNA的提取與c DNA的合成
        1.6 BCoV陽性質(zhì)粒的制備
        1.7 PCR擴增與測序
        1.8 序列的拼接及進化關系分析
    2 結(jié)果
        2.1 2017 ~2018 年中國部分省區(qū)奶牛BCo V分子流行學調(diào)查
        2.2 BCoV S、HE、N和 M完整基因的克隆結(jié)果
        2.3 BCoV S、HE、N和 M基因序列、系統(tǒng)發(fā)育和重組分析結(jié)果
    3 討論
        3.1 部分省區(qū)奶牛BCoV的病原流行病學
        3.2 BCoV S、HE、N和 M基因的分子特征
    4 小結(jié)
第三章 奶牛冠狀病毒SWUN/A10/2018 的基因組研究
    1 材料和方法
        1.1 病毒樣本
        1.2 主要儀器
        1.3 主要試劑
        1.4 引物的設計與合成
        1.5 病毒RNA的提取與c DNA的合成
        1.6 BCoV陽性質(zhì)粒的制備
        1.7 PCR擴增與測序
        1.8 全基因序列的拼接及分析
    2 結(jié)果
        2.1 分離株SWUN/A10/2018 基因組序列及結(jié)構(gòu)特征
        2.2 分離株SWUN/A10/2018 毒株S基因分子特征
        2.3 分離株SWUN/A10/2018 毒株HE基因分子特征
        2.4 分離株SWUN/A10/2018 毒株N、M和 E基因分子特征
        2.5 分離株SWUN/A10/2018 毒株ORF1a和 ORF1b基因分子特征
    3 討論
        3.1 SWUN/A10/2018 基因組特征
        3.2 SWUN/A10/2018 S基因的分子特征
        3.3 SWUN/A10/2018 HE基因變異
    4 小結(jié)
第四章 基于重組N蛋白檢測BCoV抗體的間接ELISA試劑盒的研發(fā)
    1 材料和方法
        1.1 主要質(zhì)粒、試驗用血清
        1.2 主要儀器
        1.3 主要試劑
        1.4 BCoV重組N蛋白的表達
        1.5 基于重組N蛋白間接ELISA檢測方法條件的優(yōu)化
        1.6 間接ELISA方法陰陽性臨界值的確定
        1.7 基于重組N蛋白間接ELISA檢測方法的評價
        1.8 試劑盒的組裝
        1.9 對川西北牦牛血清BCo V流行病學調(diào)查
    2 結(jié)果
        2.1 重組原核表達載體的構(gòu)建結(jié)果
        2.2 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達及SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果
        2.3 表達蛋白的回收、純化及Western blot鑒定結(jié)果
        2.4 基于重組N蛋白間接ELISA檢測方法條件的優(yōu)化結(jié)果
        2.5 間接ELISA方法陰陽性臨界值的確定結(jié)果
        2.6 基于重組N蛋白間接ELISA檢測方法的評價結(jié)果
        2.7 試劑盒的組裝結(jié)果
        2.8 對川西北牦牛血清BCo V流行病學調(diào)查結(jié)果
    3 討論
        3.1 BCoV的間接ELISA方法
        3.2 BCoV的重組N蛋白的表達
        3.3 基于重組N蛋白檢測BCo V抗體的間接ELISA方法的建立
    4 小節(jié)
結(jié)論及創(chuàng)新
參考文獻
作者在攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文
致謝



本文編號：3734945