目的：為建立結(jié)核桿菌快速藥敏檢測(cè)技術(shù)，縮短獲得藥敏檢測(cè)結(jié)果的時(shí)間，及時(shí)為患者提供正確的治療方案。我們將PMA-qPCR偶聯(lián)技術(shù)應(yīng)用于結(jié)核桿菌耐藥診斷，以期對(duì)結(jié)核桿菌耐藥性做出快速檢測(cè)。 方法：根據(jù)GenBank中公布的結(jié)核分支桿菌16sRNA基因的保守序列選取一段長為206bp的基因片段設(shè)計(jì)引物。以qPCR所得初始模板量的多少作為PMA抑制死菌擴(kuò)增的判定標(biāo)準(zhǔn)。用二甲基亞砜將PMA稀釋到0.5mg/ml，并將PMA與結(jié)核分枝桿菌樣品進(jìn)行作用，用以選取和優(yōu)化以下試驗(yàn)條件： （1）終濃度為3ug/ml的PMA與結(jié)核單菌懸液作用，設(shè)置不同曝光時(shí)間，選取PMA與DNA共價(jià)交聯(lián)及游離PMA完全鈍化的最佳曝光時(shí)間，并以此作為后續(xù)試驗(yàn)中的曝光時(shí)間；（2）用熱滅活、超聲裂解和紫外照射法將結(jié)核桿菌殺死并分別與3ug/ml的PMA作用，曝光后進(jìn)行qPCR，通過CT值分析PMA對(duì)死菌擴(kuò)增的抑制效果，選取結(jié)核分支桿菌死菌懸液制備的最佳方法；（3）不同濃度的PMA與結(jié)核分支桿菌活菌相互作用后，在650W鹵素?zé)粝缕毓?5min，根據(jù)qPCR結(jié)果選擇不抑制結(jié)核分支桿菌活菌擴(kuò)增的最小PMA濃度；（4）用熱滅... 

【文章頁數(shù)】：52 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
導(dǎo)師評(píng)閱表
課題來源
摘要
英文摘要
英文縮略詞表
前言
第一章 文獻(xiàn)綜述
    前言
    1 傳統(tǒng)的生長檢測(cè)為基礎(chǔ)的藥敏試驗(yàn)
    2 以快速培養(yǎng)生長檢測(cè)為基礎(chǔ)的藥敏試驗(yàn)
        2.1 顯微鏡觀察藥敏檢測(cè)技術(shù)（MODS）
        2.2 BACTEC460系統(tǒng)
        2.3 BactecMGIT960系統(tǒng)
        2.4 噬菌體檢測(cè)法
    3 以檢測(cè)基因突變?yōu)榛A(chǔ)的快速藥敏試驗(yàn)
        3.1 以檢測(cè)DNA單鏈構(gòu)象為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法的研究
        3.2 以檢測(cè)熒光共振能量傳遞為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法
        3.3 以異源雙鏈結(jié)構(gòu)分析為基礎(chǔ)的方法
    4 商品化的突變檢測(cè)技術(shù)
        4.1 基因芯片技術(shù)
        4.2 GeneXpert檢測(cè)系統(tǒng)
        4.3 結(jié)核分枝桿菌線性探針技術(shù)
    5 直接測(cè)序法
    6 高分辨率溶解曲線（HRM）
第二章 實(shí)驗(yàn)部分
    實(shí)驗(yàn)一 三種死菌懸液制備方法對(duì)PMA-qPCR結(jié)果的影響
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            2.1 PMA對(duì)DNA擴(kuò)增抑制效果的評(píng)估
            2.2 熱滅活法對(duì)PMA-qPCR結(jié)果的影響
            2.3 超聲裂解致死法對(duì)PMA-qPCR結(jié)果的影響
            2.4 紫外照射致死法對(duì)PMA-qPCR檢測(cè)結(jié)果的影響
            2.5 三種制備死菌方法的比較
        3 討論
    實(shí)驗(yàn)二 PMA-qPCR快速檢測(cè)結(jié)核活菌方法的建立
        摘要
        1 材料與方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 結(jié)果與分析
            2.1 最佳曝光時(shí)間
            2.2 不抑制活菌擴(kuò)增的最小PMA濃度
            2.3 完全抑制死菌擴(kuò)增的最小PMA濃度
            2.4 PMA-qPCR對(duì)不同比例活/死菌的檢測(cè)
            2.5 qPCR檢測(cè)的靈敏性
        3 討論
    實(shí)驗(yàn)三 PMA-qPCR技術(shù)應(yīng)用于結(jié)核耐藥菌的快速鑒別診斷方法的初步研究
        摘要
        1 材料與方法
            1.1 材料
            1.2 方法
            1.3 結(jié)核單菌懸液的制備
            1.4 PMA和樣品的處理方法
            1.5 抗結(jié)核藥物的藥效學(xué)檢測(cè)（刃天青藥敏檢測(cè)法）
            1.6 PMA-qPCR反應(yīng)體系
            1.7 PMA-qPCR對(duì)結(jié)核藥敏試驗(yàn)的檢測(cè)
        2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            2.1 刃天青藥敏試驗(yàn)檢測(cè)藥物的有效性
            2.2 PMA-qPCR對(duì)結(jié)核桿菌藥敏檢測(cè)結(jié)果
        3 討論
實(shí)驗(yàn)總結(jié)
創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介及發(fā)表論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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