天然人組織纖溶酶原激活劑（t-PA）存在半衰期短,容易失活,內(nèi)出血風險等問題,而我們進行相應(yīng)改造的重組人組織纖溶酶原激活劑（rhPA）則具有半衰期延長、產(chǎn)量提高、與人體相容性高等優(yōu)點。本實驗室構(gòu)建的重組PCL25/rhPA表達載體內(nèi)含有CMV增強子調(diào)控元件以及獲得的轉(zhuǎn)基因純合子兔整合拷貝數(shù)2倍于半合子,導致了其高效表達的能力,表達產(chǎn)量及活性的提高,有助于表達水平較高的轉(zhuǎn)基因兔進行純合子培育及傳代擴系�，F(xiàn)階段目前臨床上應(yīng)用的t-PA及其突變體大多是在原核大腸桿菌中表達,少部分由動物或昆蟲細胞表達,從乳汁中分離純化rhPA尚未見報道。我利用多種純化手段,研究從轉(zhuǎn)基因兔乳中將rhPA分離出來的方法,從而確保從轉(zhuǎn)基因兔乳中純化的rhPA的純度、生物活性及穩(wěn)定性。乳腺特異性表達rhPA轉(zhuǎn)基因兔的篩選與繁育將山羊BLG信號肽編碼區(qū)和人t-PA的K2和P結(jié)構(gòu)域的編碼序列克隆到含有山羊β-酪蛋白基因的5’基因組片段和CMV啟動子/增強子的PCL25載體中作為嵌合啟動子/增強子,構(gòu)建了 PCL25/rhPA乳腺特異性表達載體。經(jīng)原核顯微注射PCL25/rhPA表達載體線性片段后,共獲得存活仔兔48只,經(jīng)... 

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
符號說明
第一章 文獻綜述
    1 乳腺生物反應(yīng)器
        1.1 乳腺生物反應(yīng)器的特點
        1.2 乳腺生物反應(yīng)器的研究應(yīng)用
        1.3 乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組人組織纖溶酶原激活劑
    2 人組織纖溶酶原激活劑
        2.1 人組織纖溶酶原激活劑的結(jié)構(gòu)與功能
        2.2 重組人組織纖溶酶原激活劑的研究應(yīng)用
    3 顯微注射法制備乳腺特異性表達轉(zhuǎn)基因動物
    4 轉(zhuǎn)基因純合子動物的特性研究
    5 乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)乳蛋白的分離純化
        5.1 乳中主要蛋白質(zhì)的分析及重組蛋白分離的特點
        5.2 乳蛋白分離純化技術(shù)
            5.2.1 親和層析
            5.2.2 離子交換層析
            5.2.3 凝膠過濾層析
        5.3 人組織纖溶酶原激活劑及其變體的分離純化研究
第二章 重組人纖溶酶原激活劑(rhPA)轉(zhuǎn)基因兔的制備及篩選
    1 實驗材料
        1.1 實驗動物
        1.2 主要器材
        1.3 主要試劑及配制
    2 實驗方法
        2.1 轉(zhuǎn)基因兔的制備
            2.1.1 構(gòu)建及基因片段的準備
            2.1.2 超數(shù)排卵與同期發(fā)情
            2.1.3 回收受精卵
            2.1.4 受精卵顯微注射
            2.1.5 胚胎移植
        2.2 轉(zhuǎn)基因兔的整合檢測
            2.2.1 兔基因組的提取
            2.2.2 PCR檢測與測序
        2.3 轉(zhuǎn)基因兔乳腺表達產(chǎn)物分析
            2.3.1 兔乳汁的收集與提取
            2.3.2 ELISA法檢測轉(zhuǎn)基因兔乳清
            2.3.3 SDS-PAGE電泳法分析轉(zhuǎn)基因兔乳清
            2.3.4 Western Blot分析轉(zhuǎn)基因兔乳清
            2.3.5 FAPA法檢測表達產(chǎn)物的體外溶栓生物活性功能
        2.4 轉(zhuǎn)基因純合子兔的篩選培育
    3 結(jié)果
        3.1 轉(zhuǎn)基因兔的獲得及篩選
        3.2 轉(zhuǎn)rhPA基因純合子兔的篩選
        3.3 轉(zhuǎn)基因兔乳腺表達產(chǎn)物分析
            3.3.1 轉(zhuǎn)基因兔乳清的ELISA檢測
            3.3.2 轉(zhuǎn)基因兔乳清的SDS-PAGE電泳和Western Blot檢測
            3.3.3 體外溶栓檢測
    4 討論
第三章 轉(zhuǎn)基因兔乳中rhPA的分離純化及鑒定
    1 材料
        1.1 rhPA乳樣
        1.2 主要器材和儀器
        1.3 主要試劑與配制
    2 實驗方法
        2.1 轉(zhuǎn)基因兔乳前處理
            2.1.1 乳清的提取
            2.1.2 硫酸銨沉淀
            2.1.3 酸堿沉淀
            2.1.4 超濾
        2.2 親和層析純化轉(zhuǎn)基因兔乳中rhPA
            2.2.1 賴氨酸親和層析(Lysine HyperD)純化乳清
            2.2.2 染料親和層析(Blue Sepharose 6FF)純化乳清
        2.3 離子交換層析(SP Bestarose~(TM) FF)純化轉(zhuǎn)基因兔乳中rhPA
        2.4 凝膠過濾層析(Surpdex G75)純化轉(zhuǎn)基因兔乳中rhPA
        2.5 ELISA、SDS-PAGE、Western Blot法分析純化產(chǎn)物
        2.6 FAPA法檢測表達產(chǎn)物的體外溶栓生物活性功能
        2.7 分子量及序列測定(N端/C端)鑒定純化產(chǎn)物
    3 結(jié)果
        3.1 乳樣前處理的結(jié)果
        3.2 賴氨酸親和層析(Lysine HyperD)純化結(jié)果
        3.3 染料親和層析(Blue Sepharose 6FF)純化結(jié)果
        3.4 離子交換層析(SP Bestarose~(TM）FF)純化結(jié)果
        3.5 凝膠過濾層析(Surpdex G75)純化結(jié)果
        3.6 純化產(chǎn)物的初步鑒定
        3.7 FAPA法檢測純化產(chǎn)物體外溶栓生物活性功能
        3.8 分子量及序列測定(N端/C端)鑒定純化產(chǎn)物
    4 討論
全文總結(jié)
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]乳腺生物反應(yīng)器的研究和產(chǎn)業(yè)化進展[J]. 付玉華,周秀梅,錢其軍.  中國畜牧獸醫(yī). 2010(08)
[2]轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器研究進展[J]. 朱小甫,渠敬峰,吳旭錦,樊松濤,馬秋明,高睿.  畜牧獸醫(yī)雜志. 2007(03)
[3]奶山羊乳腺瞬時表達溶栓藥物瑞替普酶-reteplase（rPA）的研究[J]. 徐寒梅,沈子龍,成國祥,奚濤,吳梧桐.  藥物生物技術(shù). 2006(03)
[4]動物乳腺生物反應(yīng)器的原理及研究進展[J]. 張忠誠.  中國奶牛. 2006(04)
[5]山羊乳腺生物反應(yīng)器表達人促紅細胞生成素的分離純化[J]. 田陽,苗靜,陳光玉,陳輝,成國祥.  中國生物工程雜志. 2004(08)
[6]紅系特異的GFP基因在轉(zhuǎn)基因小鼠中的整合和表達[J]. 顏景斌,肖艷萍,陳美玨,黃淑幀,曾溢滔.  動物學報. 2004(02)
[7]重組人組織型纖溶酶原激活劑（rht-PA）及其突變體的純化[J]. 朱恒奇,徐秀英,黃培堂.  中國生物化學與分子生物學報. 2003(01)
[8]重組蛋白質(zhì)純化技術(shù)[J]. 陳浩,陳于紅,朱德煦,劉建寧.  中國生物工程雜志. 2002(05)
[9]重組刺桐胰蛋白酶抑制劑a的制備及其在tPA突變體純化中的應(yīng)用[J]. 王新,屈賢銘,楊勝利.  生物化學與生物物理進展. 2002(03)
[10]tPA乳腺組織特異性表達載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因小鼠建立[J]. 趙寶全,張守峰,趙君,扈榮良,章金鋼,殷震.  中國獸醫(yī)學報. 2002(02)

博士論文
[1]利用精子載體方法研制人組織型纖溶酶原激活劑突變體轉(zhuǎn)基因羊乳腺生物反應(yīng)器[D]. 葉華虎.中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院 2005

碩士論文
[1]溶栓藥物瑞替普酶（rPA）的大腸桿菌表達研究[D]. 田文靜.天津科技大學 2010
[2]人組織型纖溶酶原激活劑原核表達載體的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的初步表達[D]. 楊震.重慶醫(yī)科大學 2012
[3]重組組織型纖溶酶原激活劑-RGDS肽融合蛋白的表達、純化及鑒定[D]. 龍小濱.重慶醫(yī)科大學 2015



本文編號：3724574