胚胎生殖細(xì)胞（EG）是從胎兒原始生殖細(xì)胞（PGCs）分離培養(yǎng)出來的具有發(fā)育多潛能性的一種多潛能干細(xì)胞。傳統(tǒng)的胚胎干細(xì)胞（ES）多從囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）獲得,如小鼠ES。但對大家畜而言,很難獲得充足的囊胚,ES建系也還沒有成功。自從PGCs來源的小鼠EG細(xì)胞建立后,通過檢測mEG的生物學(xué)特性和mES相似,使人們有理由相信,由其他物種的PGCs也同樣能夠獲得EG細(xì)胞。雖然關(guān)于豬EG細(xì)胞的獲得早有報道,但是,至今仍然未能建成與小鼠ES和EG一樣穩(wěn)定的細(xì)胞系。原因是多方面的,一是我們對豬PGCs的發(fā)生、增殖、遷移等過程缺少了解；二是我們對豬PGCs的表觀遺傳學(xué)變化研究甚少;三是PGCs細(xì)胞體外培養(yǎng)體系仍有待完善。本研究選擇豬胚胎發(fā)育22天至30天的生殖嵴為研究對象,通過組織切片技術(shù)對生殖嵴形態(tài)及PGCs在體內(nèi)的遷移進(jìn)行了跟蹤；利用Realtime PCR及亞硫酸氫鹽測序技術(shù)對印記基因的表達(dá)及甲基化水平進(jìn)行了分析；通過對不同胎齡、不同飼養(yǎng)層、不同的傳代方法的比較對類EG細(xì)胞的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,期望在認(rèn)知豬PGCs體內(nèi)生物學(xué)變化規(guī)律的基礎(chǔ)上優(yōu)化體外培養(yǎng)條件,最終獲得穩(wěn)定傳代的豬EG細(xì)胞系。主... 

【文章頁數(shù)】：87 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 豬多能干細(xì)胞研究進(jìn)展
        1.1.1 胚胎干細(xì)胞(ES)的研究進(jìn)展
        1.1.2 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS)的研究進(jìn)展
        1.1.3 胚胎生殖細(xì)胞(EG)的研究進(jìn)展
    1.2 哺乳動物原始生殖細(xì)胞的發(fā)育
        1.2.1 原始生殖細(xì)胞特化的信號調(diào)控
        1.2.2 小鼠原始生殖細(xì)胞的遷移
        1.2.3 人原始生殖細(xì)胞的遷移
        1.2.4 豬原始生殖細(xì)胞的遷移
        1.2.5 原始生殖細(xì)胞甲基化的去除與重建
    1.3 胚胎生殖細(xì)胞培養(yǎng)的影響因素
        1.3.1 飼養(yǎng)層對胚胎生殖細(xì)胞的影響
        1.3.2 細(xì)胞生長因子對胚胎生殖細(xì)胞的影響
        1.3.3 胚胎日齡對胚胎生殖細(xì)胞的影響
        1.3.4 分離方法對胚胎生殖細(xì)胞的影響
        1.3.5 胚胎生殖細(xì)胞的傳代
        1.3.6 胚胎生殖細(xì)胞的鑒定
    1.4 本研究的目的意義
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗動物
        2.1.2 主要儀器設(shè)備
        2.1.3 主要試劑及試劑盒
        2.1.4 常用試劑及配制
        2.1.5 主要的生物信息學(xué)網(wǎng)站及分析軟件
    2.2 實驗方法
        2.2.1 豬生殖嵴組織學(xué)切片制作
        2.2.2 蘇木素-伊紅染色
        2.2.3 組織切片免疫熒光
        2.2.4 豬原始生殖細(xì)胞的分離
        2.2.5 Realtime PCR
        2.2.6 亞硫酸氫鹽修飾后測序的甲基化分析
        2.2.7 胚胎生殖細(xì)胞培養(yǎng)用飼養(yǎng)層的制備
        2.2.8 胚胎生殖細(xì)胞的原代培養(yǎng)
        2.2.9 胚胎生殖細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
        2.2.10 豬胚胎生殖細(xì)胞的鑒定
3 結(jié)果與分析
    3.1 豬生殖嵴形態(tài)變化及原始生殖細(xì)胞跟蹤
        3.1.1 豬生殖嵴形態(tài)變化跟蹤
        3.1.2 豬原始生殖細(xì)胞在體內(nèi)遷移跟蹤
    3.2 豬原始生殖細(xì)胞印記基因表達(dá)的變化
        3.2.1 Realtime PCR反應(yīng)的特異性
        3.2.2 印記基因的表達(dá)
    3.3 豬原始生殖細(xì)胞印記基因甲基化的變化
        3.3.1 IGF2基因的甲基化
        3.3.2 H19基因的甲基化
    3.4 豬胚胎生殖細(xì)胞的培養(yǎng)
        3.4.1 飼養(yǎng)層細(xì)胞的形態(tài)特征
        3.4.2 胚胎生殖細(xì)胞的形態(tài)特征
        3.4.3 不同胚胎日齡對胚胎生殖細(xì)胞培養(yǎng)的影響
        3.4.4 不同來源飼養(yǎng)層對胚胎生殖細(xì)胞培養(yǎng)的影響
        3.4.5 不同傳代方式對胚胎生殖細(xì)胞培養(yǎng)的影響
        3.4.6 胚胎生殖細(xì)胞的鑒定
4 討論
    4.1 豬原始生殖細(xì)胞的遷移
        4.1.1 生殖嵴的形成
        4.1.2 原始生殖細(xì)胞的遷移
    4.2 印記基因的研究
        4.2.1 DNA甲基化與基因表達(dá)
        4.2.2 印記基因的甲基化
    4.3 胚胎生殖細(xì)胞培養(yǎng)的影響因素
        4.3.1 飼養(yǎng)層細(xì)胞對胚胎生殖細(xì)胞培養(yǎng)的影響
        4.3.2 胚胎日齡對胚胎生殖細(xì)胞培養(yǎng)的影響
        4.3.3 胚胎生殖細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀博士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3723269