羊泰勒蟲�。∣vine and caprine theileriosis）是媒介蜱傳播的由泰勒科泰勒屬的原蟲寄生于綿羊和山羊巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞內(nèi)所引起的疾病的總稱。嚴(yán)重影響了畜牧業(yè)的發(fā)展。本研究從呂氏泰勒蟲裂殖子cDNA表達(dá)文庫中克隆出T1SP基因,通過構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒,進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和純化,得到重組rT1SP抗原。經(jīng)Western-blot方法分析證實(shí)T1SP表達(dá)蛋白的反應(yīng)性。經(jīng)過真核轉(zhuǎn)染用激光共聚焦顯微技術(shù)對(duì)其在Vero細(xì)胞中表達(dá)蛋白進(jìn)行定位,最后建立檢測羊泰勒蟲的間接ELISA方法。為今后羊泰勒蟲病的免疫學(xué)診斷和基因工程疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。 克隆呂氏泰勒蟲（Theileria luwenshuni）T1SP基因的功能區(qū)片段,以呂氏泰勒蟲cDNA表達(dá)文庫為模板,PCR擴(kuò)增出T1SP基因片段,構(gòu)建成pET-30a-T1SP重組質(zhì)粒,通過誘導(dǎo)表達(dá),獲得了可溶性表達(dá)蛋白,并對(duì)其用鎳柱進(jìn)行親和層析純化,得到重組rT1SP抗原,用Western-blot分析了T1SP表達(dá)蛋白與尤氏泰勒蟲（T. uilenbergi）、綿羊泰勒蟲（T. ovis）、以及環(huán)形泰勒蟲（T. an... 

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
目錄
英文縮略表
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 泰勒蟲病的概況
        1.1.1 羊泰勒蟲的分類
        1.1.2 羊泰勒蟲的傳播媒介
        1.1.3 泰勒蟲的形態(tài)與致病情況
    1.2 羊泰勒蟲的診斷方法
        1.2.1 血涂片檢查
        1.2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)
        1.2.3 間接熒光抗體技術(shù)(IFAT)
        1.2.4 半巢式PCR(semi-nested PCR)
        1.2.5 環(huán)介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)
        1.2.6 酶聯(lián)免疫反應(yīng)技術(shù)(ELISA)
    1.3 羊泰勒蟲的研究現(xiàn)狀
    1.4 研究目標(biāo)
        1.4.1 呂氏泰勒蟲T1SP基因的克隆、生物信息分析和原核表達(dá)
        1.4.2 呂氏泰勒蟲T1SP基因在真核細(xì)胞的表達(dá)與定位
        1.4.3 T1SP抗原的間接ELISA抗體檢測羊泰勒蟲方法的建立
第2章 呂氏泰勒蟲T1SP基因的克隆、生物信息分析和原核表達(dá)
    2.1 引言
    2.2 材料、試劑與儀器
        2.2.1 菌株、載體
        2.2.2 試驗(yàn)試劑
        2.2.3 試驗(yàn)儀器
        2.2.4 呂氏泰勒蟲T1SP基因的生物信息學(xué)分析
    2.3 呂氏泰勒蟲T1SP基因的克隆
        2.3.1 引物設(shè)計(jì)
        2.3.2 PCR擴(kuò)增
        2.3.3 膠回收
        2.3.4 pGEM-T Easy載體的連接
        2.3.5 轉(zhuǎn)化
        2.3.6 pGEM-T-T1SP質(zhì)粒的提取
    2.4 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-T1SP的構(gòu)建
        2.4.1 雙酶切
        2.4.2 連接
        2.4.3 PCR鑒定
    2.5 pET-30a-T1SP的原核表達(dá)
    2.6 表達(dá)蛋白的純化與透析
        2.6.1 純化
        2.6.2 透析
    2.7 Western-blot分析
        2.7.1 SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳
        2.7.2 轉(zhuǎn)膜(半干轉(zhuǎn))
    2.8 羊抗T1SP蛋白多抗的制備
    2.9 結(jié)果與分析
        2.9.1 T1SP基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果
        2.9.2 T1SP基因序列
        2.9.3 T1SP基因翻譯的氨基酸序列
        2.9.4 T1SP基因抗原表位分析預(yù)測
        2.9.5 重組蛋白的表達(dá)和純化
        2.9.6 Western-blot分析結(jié)果
    2.10 討論
    2.11 小結(jié)
第3章 呂氏泰勒蟲T1SP基因在真核細(xì)胞的表達(dá)與定位
    3.1 材料與方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 主要儀器
        3.1.3 T1SP基因的引物設(shè)計(jì)
        3.1.4 PCR擴(kuò)增
        3.1.5 pEGFP-N1-T1SP重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.1.6 重組質(zhì)粒的提取
        3.1.7 Vero細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
        3.1.8 細(xì)胞爬片的制作與亞細(xì)胞定位
        3.1.9 Western-blot分析重組質(zhì)粒pEGFP-N1-T1SP的表達(dá)
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 T1SP基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果
        3.2.2 重組質(zhì)粒pEGFP-N1-T1SP的PCR鑒定
        3.2.3 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染
        3.2.4 重組質(zhì)粒pEGFP-N1-T1SP在Vero細(xì)胞中的定位
        3.2.5 表達(dá)與Western-blot分析
    3.3 討論
    3.4 小結(jié)
第4章 rT1SP抗原的間接ELISA抗體檢測羊泰勒蟲方法的建立
    4.1 材料與方法
        4.1.1 血清
        4.1.2 抗原的制備
        4.1.3 主要試劑
        4.1.4 試驗(yàn)儀器
        4.1.5 抗原的最佳包被濃度
        4.1.6 血清和酶標(biāo)抗體的稀釋度
        4.1.7 間接ELISA判定標(biāo)準(zhǔn)
        4.1.8 交叉反應(yīng)檢測
        4.1.9 臨床樣品檢測
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 抗原的最佳包被濃度
        4.2.2 血清和酶標(biāo)抗體的稀釋度
        4.2.3 臨界值的判定標(biāo)準(zhǔn)
        4.2.4 交叉反應(yīng)結(jié)果
        4.2.5 臨床樣品檢測結(jié)果
        4.2.6 rT1SP蛋白多抗的持續(xù)時(shí)間
    4.3 討論
    4.4 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄A 攻讀學(xué)位期間所發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]牛環(huán)形泰勒蟲GST-Tams1融合蛋白間接ELISA檢測方法的建立[J]. 簡子健,馬素貞,黃家雨,孫其吉吉,沈炯玉,苗中秋,呂偉.  新疆農(nóng)業(yè)科學(xué). 2011(03)
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博士論文
[1]我國羊泰勒蟲的生物學(xué)特性研究[D]. 李有全.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2007



本文編號(hào)：3721268