天然免疫系統(tǒng)是機體抵抗外來微生物入侵的第一道防線。干擾素基因刺激因子STING（Stimulator of interferon genes）是天然免疫信號通路中重要的銜接蛋白。細胞內第二信使環(huán)磷酸鳥苷-腺苷（Cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate,c GAMP）是STING的內源性激活劑,二者結合后可以活化STING/TBK1/IRF3信號通路,最終激活I型干擾素（Type I interferon）的表達。為了建立基于STING為靶點的抗病毒小分子化合物篩選工具,本文使用慢病毒介導的CRISPR/Cas9基因組編輯技術建立了STING基因敲除豬肺巨噬細胞系。通過設計單鏈引導RNA（Single guide RNA,sg RNA）構建重組質粒pSTING-sgRNA,將質粒轉染人胚胎腎細胞（Human embryonic kidney 293T/17,HEK293/T17）收取慢病毒并感染3D4/21豬肺巨噬細胞,經嘌呤霉素（Puromycin）篩選獲得STING基因敲除多克隆細胞系。再通過有限稀釋法,獲得STIN... 

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
英文縮略表
摘要
1.文獻綜述
    1.1 天然免疫概述
    1.2 天然免疫系統(tǒng)識別病原分子
        1.2.1 Toll樣受體家族
        1.2.2 DNA識別受體家族
        1.2.3 RNA識別受體家族
        1.2.4 其他的PRRs
    1.3 STING的發(fā)現(xiàn)及臨床意義
        1.3.1 STING的結構
        1.3.2 STING的抗病毒機制
        1.3.3 STING與G10
    1.4 干擾素的簡介
        1.4.1 干擾素的分類
        1.4.2 干擾素抗病毒的作用機制
        1.4.3 干擾素刺激因子
    1.5 偽狂犬病
        1.5.1 偽狂犬病
        1.5.2 PRV的生物學特性
        1.5.3 PRV與DNA識別受體
    1.6 CRISPR/Cas9的研究進展
        1.6.1 CRISPR/Cas9的結構及原理
        1.6.2 CRISPR/Cas9的優(yōu)勢及局限
    1.7 展望
2.引言
3.材料與方法
    3.1 材料
        3.1.1 細胞和病毒
        3.1.2 細胞培養(yǎng)耗材
        3.1.3 感受態(tài)和質粒
        3.1.4 主要儀器設備
        3.1.5 主要試劑
        3.1.6 常規(guī)生化試劑的配制
    3.2 試驗方法
        3.2.1 E.coli Top10感受態(tài)的制備
        3.2.2 引物設計與合成
            3.2.2.1 sgRNA引物設計與合成
            3.2.2.2 PCR克隆引物設計與合成
            3.2.2.3 Q-PCR克隆引物設計與合成
        3.2.3 pSTING-sgRNA載體構建
            3.2.3.1 sgRNA引物退火
            3.2.3.2 質粒酶切與回收
            3.2.3.3 重組質粒的連接與轉化
            3.2.3.4 質粒提取
        3.2.4 3D4/21-STING~(-/-)多克隆細胞系構建
            3.2.4.1 STING-sgRNA慢病毒的包裝
            3.2.4.2 感染細胞篩選細胞系
            3.2.4.3 細胞基因組提取
            3.2.4.4 PCR擴增及切膠純化
            3.2.4.5 T7酶切檢測
        3.2.5 3D4/21-STING~(-/-)單克隆細胞系的篩選
        3.2.6 酶標儀檢測
        3.2.7 熒光觀察及流式檢測
        3.2.8 PRV病毒滴度的測定
            3.2.8.1 病毒的擴增和收取
            3.2.8.2 病毒滴度的測定
        3.2.9 實時熒光定量PCR
            3.2.9.1 細胞總RNA的提取
            3.2.9.2 反轉錄合成cDNA
            3.2.9.3 熒光定量PCR檢測
            3.2.9.4 mRNA相對表達量的計算
        3.2.10 數(shù)據(jù)處理
4.結果與分析
    4.1 豬STING-sgRNA重組質粒的構建及鑒定
        4.1.1 52961質粒酶切結果
        4.1.2 質粒測序結果
    4.2 3D4/21-STING~(-/-)多克隆細胞系的構建
        4.2.1 STING基因編輯效率的檢測
        4.2.2 T7酶切鑒定
    4.3 3D4/21-STING~(-/-)單克隆細胞系的篩選
    4.4 G10抑制PRV-GFP在3D4/21-WT細胞中的復制
    4.5 3D4/21-STING~(-/-)單克隆細胞系的鑒定
        4.5.1 STING基因敲除對PRV-GFP病毒復制的影響
        4.5.2 STING基因敲除對PRV-GFP和PRV-QXX病毒滴度的影響
        4.5.3 STING基因敲除對ISG基因的影響
5.討論與結論
    5.1 討論
    5.2 結論
參考文獻
英文摘要



本文編號：3719449