發(fā)布時(shí)間：2022-12-05 20:14

　　豬細(xì)小病毒（porcine parvovirus,PPV）屬于細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒亞科、細(xì)小病毒屬病毒,是引起母豬繁殖障礙的主要病原之一,臨床表現(xiàn)為初孕母豬不孕、流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎和死胎等現(xiàn)象。PPV在全球大部分地區(qū)呈地方性流行,在未接種疫苗或疫苗接種不當(dāng)?shù)呢i群中可造成毀滅性的流產(chǎn)風(fēng)暴。大量研究報(bào)道,PPV感染可引起胎兒或仔豬的多種組織臟器發(fā)生損傷進(jìn)而引起胎兒死亡或產(chǎn)弱仔等,并以此解釋PPV誘導(dǎo)繁殖障礙的原因,但是,關(guān)于PPV感染對(duì)妊娠母體的影響卻鮮有報(bào)道。卵巢黃體是建立和維持妊娠的重要組織,主要通過黃體細(xì)胞合成孕酮以維持正常的妊娠。已有研究報(bào)道,PPV感染可導(dǎo)致母體黃體組織受損,進(jìn)而引起不孕和流產(chǎn)等病理現(xiàn)象的發(fā)生,但其具體作用分子機(jī)制尚不清楚。本研究首先建立永生化黃體細(xì)胞系,為后續(xù)研究提供可靠的細(xì)胞模型。然后用PPV分別感染原代和永生化豬黃體細(xì)胞,檢測(cè)PPV感染誘導(dǎo)黃體細(xì)胞凋亡和凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,明確PPV感染抑制黃體細(xì)胞孕酮產(chǎn)生及相應(yīng)機(jī)制。最后,PPV感染初孕母豬,從體內(nèi)水平進(jìn)一步驗(yàn)證PPV感染誘導(dǎo)黃體細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和抑制孕酮產(chǎn)生的機(jī)制。旨在從體外和體內(nèi)水平探討PPV感染誘導(dǎo)... 

【文章頁數(shù)】：111 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
文獻(xiàn)綜述
    第一章 病毒誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡研究進(jìn)展
        1.1 病毒感染誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡
            1.1.1 病毒量與細(xì)胞凋亡
            1.1.2 病毒抗體與細(xì)胞凋亡
        1.2 病毒感染誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
            1.2.1 病毒感染誘導(dǎo)死亡受體通路研究
            1.2.2 病毒感染誘導(dǎo)線粒體通路研究
            1.2.3 病毒感染誘導(dǎo)p53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究
            1.2.4 病毒感染誘導(dǎo)MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究
        1.3 細(xì)小病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
        1.4 本研究的目的意義
試驗(yàn)研究
    第二章 永生化豬黃體細(xì)胞系的建立與鑒定
        2.1 試驗(yàn)材料
            2.1.1 卵巢組織
            2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            2.1.3 質(zhì)粒和細(xì)胞
            2.1.4 主要試劑
            2.1.5 主要試劑的配置
            2.1.6 主要儀器
        2.2 試驗(yàn)方法
            2.2.1 原代豬黃體細(xì)胞的分離、純化
            2.2.2 3β-HSD活性染色和Oil-Red-O染色鑒定
            2.2.3 豬黃體細(xì)胞的永生化
            2.2.4 轉(zhuǎn)染后的豬黃體細(xì)胞端粒酶基因表達(dá)及活性鑒定
            2.2.5 核型分析
            2.2.6 透射電子顯微鏡觀察
            2.2.7 3β-HSD活性染色和Oil-Red-O染色鑒定轉(zhuǎn)染后黃體細(xì)胞
            2.2.8 臺(tái)盼藍(lán)法鑒定細(xì)胞活性
            2.2.9 RT-PCR法檢測(cè)類固醇激素合成相關(guān)分子的表達(dá)
            2.2.10 放射免疫法檢測(cè)LH和氯前列烯醇刺激后孕酮的產(chǎn)生
            2.2.11 Westernblotting法檢測(cè)LH和氯前列烯醇刺激后孕酮合成過程中關(guān)鍵蛋白和酶的表達(dá)
            2.2.12 軟瓊脂試驗(yàn)及裸鼠致瘤試驗(yàn)
            2.2.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
        2.3 結(jié)果
            2.3.1 永生化豬黃體細(xì)胞系的建立
            2.3.2 永生化豬黃體細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的鑒定
            2.3.3 類固醇激素合成過程中相關(guān)分子的表達(dá)
            2.3.4 LH和氯前列烯醇對(duì)黃體細(xì)胞孕酮合成的影響
            2.3.5 體內(nèi)和體外致瘤性分析
        2.4 討論
        2.5 小結(jié)
    第三章 豬細(xì)小病毒誘導(dǎo)豬黃體細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究
        3.1 試驗(yàn)材料
            3.1.1 病毒和細(xì)胞
            3.1.2 主要試劑
            3.1.3 主要儀器
        3.2 試驗(yàn)方法
            3.2.1 PPV的擴(kuò)增及病毒滴度的測(cè)定
            3.2.2 MTT法檢測(cè)PPV對(duì)黃體細(xì)胞細(xì)胞活性的影響
            3.2.3 qPCR法檢測(cè)PPV在黃體細(xì)胞中的增殖
            3.2.4 PPV感染對(duì)黃體細(xì)胞損傷的形態(tài)觀察
            3.2.5 DNA片段化分析
            3.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)
            3.2.7 分光光度法檢測(cè)caspase的活性
            3.2.8 抑制劑預(yù)處理豬黃體細(xì)胞
            3.2.9 Westernblotting法檢測(cè)死亡受體和線粒體通路主要相關(guān)蛋白的表達(dá)
            3.2.10 RT-PCR法檢測(cè)p53轉(zhuǎn)錄水平的變化
            3.2.11 Westernblotting法檢測(cè)p53蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)位以及p38MAPK、JNK總蛋白和蛋白磷酸化水平變化情況
            3.2.12 p53siRNA轉(zhuǎn)染豬黃體細(xì)胞
            3.2.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
        3.3 結(jié)果
            3.3.1 PPV感染對(duì)黃體細(xì)胞活性的影響
            3.3.2 PPV在黃體細(xì)胞中的增殖
            3.3.3 PPV感染誘導(dǎo)原代和永生化黃體細(xì)胞凋亡
            3.3.4 PPV感染經(jīng)線粒體通路誘導(dǎo)原代和永生化黃體細(xì)胞凋亡
            3.3.5 p53參與調(diào)控PPV誘導(dǎo)的黃體細(xì)胞凋亡
            3.3.6 PPV誘導(dǎo)黃體細(xì)胞中的p38MAPK發(fā)生磷酸化
            3.3.7 磷酸化p38參與調(diào)控PPV感染引起的黃體細(xì)胞凋亡
        3.4 討論
        3.5 小結(jié)
    第四章 豬細(xì)小病毒抑制豬黃體細(xì)胞孕酮產(chǎn)生機(jī)制研究
        4.1 試驗(yàn)材料
            4.1.1 病毒和細(xì)胞
            4.1.2 主要試劑
        4.2 試驗(yàn)方法
            4.2.1 放射免疫法檢測(cè)孕酮的產(chǎn)生
            4.2.2 Real-timePCR法檢測(cè)黃體細(xì)胞中孕酮合成關(guān)鍵蛋白和酶的表達(dá)
            4.2.3 Westernblotting法檢測(cè)黃體細(xì)胞中孕酮合成關(guān)鍵蛋白和酶的表達(dá)
            4.2.4 放射免疫法檢測(cè)特異性抑制劑預(yù)處理后PPV感染對(duì)黃體細(xì)胞孕酮產(chǎn)生的影響
            4.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
        4.3 結(jié)果
            4.3.1 PPV感染抑制原代和永生化黃體細(xì)胞孕酮產(chǎn)生
            4.3.2 PPV感染對(duì)黃體細(xì)胞孕酮合成的影響
            4.3.3 調(diào)控PPV感染誘導(dǎo)黃體細(xì)胞凋亡過程的相關(guān)因子對(duì)黃體細(xì)胞孕酮產(chǎn)生的影響
        4.4 討論
        4.5 小結(jié)
    第五章 豬細(xì)小病毒感染誘導(dǎo)初孕母豬黃體細(xì)胞凋亡及抑制孕酮產(chǎn)生研究
        5.1 試驗(yàn)材料
            5.1.1 病毒和細(xì)胞
            5.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            5.1.3 主要試劑
            5.1.4 主要試劑的配置
            5.1.5 主要儀器
        5.2 試驗(yàn)方法
            5.2.1 人工感染PPV
            5.2.2 血清中PPV抗體水平的檢測(cè)
            5.2.3 血清中孕酮含量的檢測(cè)
            5.2.4 原位雜交法檢測(cè)PPV在黃體組織中的分布及復(fù)制情況的確定
            5.2.5 Westernblotting法檢測(cè)黃體組織中PPV的表達(dá)
            5.2.6 HE染色
            5.2.7 TUNEL染色
            5.2.8 透射電子顯微鏡觀察黃體組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化
            5.2.9 Westernblotting法檢測(cè)黃體組織中細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要相關(guān)蛋白的表達(dá)
            5.2.10 Real-timePCR法檢測(cè)黃體組織中孕酮合成過程中關(guān)鍵蛋白和酶基因的表達(dá)
            5.2.11 Westernblotting法檢測(cè)黃體組織中孕酮合成過程中關(guān)鍵蛋白及酶的表達(dá).
            5.2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
        5.3 結(jié)果
            5.3.1 人工感染PPV不同時(shí)間妊娠豬血清中PPV抗體水平的變化
            5.3.2 人工感染PPV不同時(shí)間妊娠豬血清中孕酮水平的變化
            5.3.3 人工感染PPV不同時(shí)間對(duì)初孕豬卵巢大體剖檢觀察結(jié)果
            5.3.4 人工感染PPV后PPV在黃體組織中復(fù)制及病毒載量的觀察
            5.3.5 人工感染PPV不同時(shí)間對(duì)初孕母豬黃體組織損傷和細(xì)胞凋亡的影響
            5.3.6 人工感染PPV對(duì)初孕母豬黃體組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響
            5.3.7 人工感染PPV通過線粒體通路介導(dǎo)黃體組織中細(xì)胞凋亡
            5.3.8 人工感染PPV促進(jìn)p53蛋白在黃體組織細(xì)胞中的積累
            5.3.9 人工感染PPV誘導(dǎo)黃體組織細(xì)胞中p38蛋白發(fā)生磷酸化
            5.3.10 人工感染PPV不同時(shí)間對(duì)初孕母豬黃體組織中孕酮合成相關(guān)蛋白和酶表達(dá)的影響
        5.4 討論
        5.5 小結(jié)
結(jié)論
創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
英文縮略詞及中英文對(duì)照
致謝
作者簡介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Regulation of Hepatitis C Virus Replication and Gene Expression by the MAPK-ERK Pathway[J]. Michael Roggendorf.  Virologica Sinica. 2012(05)



本文編號(hào)：3710278