研究背景：綿羊肺腺瘤（Ovine pulmonary adenomatosis, OPA）是由綿羊肺腺瘤病毒（Jaagsiekte sheep retrovirus, JSRV）引起的一種傳染性肺臟腫瘤性疾病。JSRV為p反轉(zhuǎn)錄病毒屬成員,其env基因主要編碼囊膜蛋白（JSRV-Env）,包括表面蛋白（SU）和穿膜蛋白（TM）兩個亞基。有研究表明,綿羊透明質(zhì)酸酶2（hyaluronidase2, Hyal-2）在綿羊體內(nèi)作為內(nèi)、外源性JSRV細(xì)胞受體起作用。但有關(guān)綿羊Hyal-2與JSRV-Env及其亞基之間相互作用的研究資料尚比較缺乏。 研究目的：綿羊Hyal-2作為JSRV進(jìn)入綿羊機體細(xì)胞的受體起作用,因此,深入研究綿羊Hyal-2與JSRV-Env及其亞基（SU、TM）之間的相互作用,對于揭不JSRV侵染細(xì)胞及致瘤機理具有重要意義。 研究方法： （1）運用重疊PCR方法擴增綿羊透明質(zhì)酸酶2基因（hyal-2）,并運用生物信息學(xué)軟件對其表達(dá)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。 （2）構(gòu)建綿羊透明質(zhì)酸酶2（Hyal-2）的真核表達(dá)載體,為后期建立相關(guān)穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系及進(jìn)行病毒感染... 

【文章頁數(shù)】：145 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
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摘要
Abstract
目錄
插圖和附表清單
縮略詞表
1 引言
    1.1 逆轉(zhuǎn)錄病毒概述
        1.1.1 基因組的組成
        1.1.2 生命周期
    1.2 內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒
        1.2.1 基因組組成
        1.2.2 ERVs在細(xì)胞抵抗外源性感染過程中的作用
        1.2.3 ERVs在人類胎盤形成中的作用
    1.3 綿羊肺腺瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒(JSRV)
        1.3.1 OPA的發(fā)現(xiàn)及命名
        1.3.2 OPA的病原的確定
        1.3.3 OPA的臨床癥狀及病理變化
        1.3.4 OPA的臨床診斷
        1.3.5 OPA的控制和治療
        1.3.6 OPA的流行病學(xué)特點
        1.3.7 JSRV基因組組成
    1.4 JSRV與受體相互作用
    1.5 內(nèi)源性JSRV(enJSRV)
        1.5.1 enJSRV的概述
        1.5.2 enJSRVs在生殖道中的表達(dá)
    1.6 綿羊透明質(zhì)酸酶2(Hyal-2)的作用
        1.6.1 透明質(zhì)酸酶簡介
        1.6.2 透明質(zhì)酸酶2的作用
    1.7 JSRV及enJSRV的相互作用
    1.8 JSRV的Env蛋白轉(zhuǎn)化細(xì)胞的不同機制
    1.9 參與JSRV Env介導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化信號通路
        1.9.1 PI3K依賴和非依賴型蛋白激酶通路
        1.9.2 Raf-MEK-MAPK途徑
        1.9.3 RON-Hyal-2途徑
    1.10 巢式PCR
    1.11 重疊PCR技術(shù)
        1.11.1 重疊PCR技術(shù)
        1.11.2 重疊PCR技術(shù)原理
    1.12 蛋白相互作用研究方法
        1.12.1 蛋白質(zhì)親和色譜
        1.12.2 GST pull down技術(shù)
        1.12.3 酵母雙雜交技術(shù)
        1.12.4 免疫共沉淀技術(shù)
        1.12.5 熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)
        1.12.6 雙分子熒光互補技術(shù)
    1.13 真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)
    1.14 研究目的及意義
2 實驗一 綿羊透明質(zhì)酸酶2的基因擴增與序列分析
    摘要
    2.1 材料與方法
        2.1.1 材料
        2.1.2 方法
        2.1.3 連接反應(yīng)
        2.1.4 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞
        2.1.5 菌液PCR鑒定
        2.1.6 雙酶切鑒定
        2.1.7 DNA序列測定與分析
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 重疊PCR(overlapping PCR)擴增hyal-2基因
        2.2.2 hyal-2克隆載體的構(gòu)建及鑒定
        2.2.3 DNA序列測定與分析
        2.2.4 生物信息學(xué)分析
    2.3 討論
    2.4 結(jié)論
3 實驗二 綿羊透明質(zhì)酸酶2的真核表達(dá)及鑒定
    摘要
    3.1 材料與方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 方法
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 PCR(overlapping PCR)擴增hyal-2基因
        3.2.2 hyal-2真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
    3.3 討論
    3.4 結(jié)論
4 實驗三 綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白及其亞基真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)產(chǎn)物鑒定
    摘要
    4.1 材料與方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 方法
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 含綠色熒光蛋白標(biāo)記的綿羊Env真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.2.2 含綠色熒光蛋白標(biāo)記的SU及TM真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果
        4.2.4 Western-blotting鑒定結(jié)果
    4.3 討論
    4.4 結(jié)論
5 實驗四 綿羊透明質(zhì)酸酶2與綿羊肺腺瘤囊膜蛋白及其亞基相互作用的研究
    摘要
    5.1 免疫共沉淀方法的檢測
        5.1.1 材料與方法
        5.1.2 結(jié)果
    5.2 雙分子熒光互補技術(shù)檢測Env及其亞基與Hyal-2的相互作用
        5.2.1 材料與方法
        5.2.2 結(jié)果
    5.3 討論
    5.4 結(jié)論
6 實驗五 SU蛋白與Hyal-2蛋白可能結(jié)合區(qū)域的研究
    摘要
    6.1 免疫共沉淀方法檢測缺失型SU蛋白與Hyal-2相互作用
        6.1.1 材料與方法
        6.1.2 結(jié)果
    6.2 雙分子熒光互補技術(shù)檢測可能的結(jié)合區(qū)域
        6.2.1 材料與方法
        6.2.2 結(jié)果
    6.3 討論
    6.4 結(jié)論
7 實驗六 pEGFP-C1-(env、su、tm)與 pDsRechnonomer-N1-hyal/-2共轉(zhuǎn)小鼠 NIH3T3細(xì)胞后對pik3ca、ras基因表達(dá)量變化的影響
    摘要
    7.1 材料與方法
        7.1.1 材料
        7.1.2 方法
    7.2 結(jié)果
        7.2.1 實時熒光定量PCR檢測單獨轉(zhuǎn)染env及其亞基真核表達(dá)載體后對pik3ca基因和ras基因mRNA表達(dá)的影響
        7.2.2 檢測單獨轉(zhuǎn)染env及其亞基真核表達(dá)載體后對pik3ca基因和ras基因mRNA表達(dá)的影響
        7.2.3 實時熒光定量PCR檢測分別共轉(zhuǎn)染env及其亞基與hya1-2真核表達(dá)載體后對pik3ca基因和ras基因mRNA表達(dá)的影響
    7.3 討論
    7.4 結(jié)論
8 全文結(jié)論與創(chuàng)新點
    8.1 全文結(jié)論
    8.2 創(chuàng)新點
    8.3 研究展望
致謝
參考文獻(xiàn)
作者簡介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]綿羊肺腺瘤病的病理組織學(xué)研究[D]. 鄭秉武.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 2006



本文編號：3699607