發(fā)布時(shí)間：2022-10-29 19:33

　　原始生殖細(xì)胞（Primordial germ cells,PGCs）在胚胎和個(gè)體發(fā)育過(guò)程中,經(jīng)不斷分裂發(fā)育和分化演變?yōu)槌审w動(dòng)物器官中的精子和卵細(xì)胞。體外分離培養(yǎng)兔PGCs是為胚胎早期發(fā)育機(jī)理、生殖細(xì)胞、細(xì)胞疫苗生產(chǎn)、永生化細(xì)胞等研究提供大量的細(xì)胞。但是,兔PGCs的體外培養(yǎng)方法、傳代方法以及建系仍存在許多問(wèn)題,影響了兔PGCs細(xì)胞的應(yīng)用。兔PGCs體外培養(yǎng)的試驗(yàn),除可解決這些問(wèn)題外,也可為大家畜、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的相關(guān)研究提供參考。所以建立穩(wěn)定、高效的增殖傳代兔PGCs的方法非常重要。本試驗(yàn)以兔16-20 d的胚胎為研究對(duì)象,比較了其胎齡、飼養(yǎng)層種類、飼養(yǎng)層密度、分離方法、傳代方法及細(xì)胞因子等因素對(duì)PGCs分離培養(yǎng)的影響。改善兔PGCs體外分離培養(yǎng)的條件,提高兔PGCs集落數(shù)量和質(zhì)量。為建立穩(wěn)定的兔PGCs體外分離培養(yǎng)方法提供參考。試驗(yàn)主要結(jié)果如下:1.分離培養(yǎng)鼠、兔胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryo fibroblast,MEF、rabbit embryo fibroblast,REF）。選取昆明白近交系小鼠12-15 d胎鼠和日本大耳白兔16-18 d胎兔為材料,分離MEF、REF,... 

【文章頁(yè)數(shù)】：94 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
文獻(xiàn)綜述
    1 PGCs的起源、發(fā)生
    2 PGCs譜系限定
    3 PGCs的遷移
    4 PGCs的研究進(jìn)展
        4.1 各種動(dòng)物PGCs的研究現(xiàn)狀
            4.1.1 人
            4.1.2 兔
            4.1.3 小鼠
            4.1.4 雞
            4.1.5 豬
            4.1.6 牛
            4.1.7 魚
    5 PGCs的生物學(xué)特性
        5.1 PGCs的形態(tài)和生長(zhǎng)特性
        5.2 PGCs分化的全能性
    6 PGCs的分離培養(yǎng)
        6.1 PGCs的分離方法
        6.2 PGCs的傳代方法
    7 PGCs的鑒定
        7.1 形態(tài)學(xué)及生長(zhǎng)行為鑒定
        7.2 堿性磷酸酶(AKP)染色鑒定
        7.3 發(fā)育全能性標(biāo)志基因的表達(dá)
    8 影響PGCs體外分離培養(yǎng)的因素
        8.1 胚胎日齡及獲取PGCs的時(shí)間
        8.2 分離培養(yǎng)方法
        8.3 飼養(yǎng)層
            8.3.1 飼養(yǎng)層細(xì)胞的種類
            8.3.2 飼養(yǎng)層細(xì)胞的代數(shù)和接種密度
        8.4 培養(yǎng)基
        8.5 添加物
            8.5.1 血清
            8.5.2 細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子
    9 PGCs的意義及應(yīng)用前景
試驗(yàn)一 鼠、兔胚胎成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)
    引言
    1 材料與方法
        1.1 試驗(yàn)材料
            1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物
            1.1.2 主要試劑
            1.1.3 主要儀器與設(shè)備
        1.2 主要溶液配制
            1.2.1 孕馬血清促性腺激素(PMSG)注射液
            1.2.2 人絨毛膜素性腺激素(HCG)注射液
            1.2.3 1mol/L氫氧化鈉的配制
            1.2.4 1mol/L鹽酸的配制
            1.2.5 PBS緩沖液的配制
            1.2.6 消化液的配制
            1.2.7 胚胎成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液的配制
            1.2.8 FBS的分裝與凍存
            1.2.9 雙抗的分裝與凍存
            1.2.10 凍存液的配制
        1.3 試驗(yàn)方法
            1.3.1 試驗(yàn)動(dòng)物超排
            1.3.2 MEF、REF的分離培養(yǎng)
            1.3.3 首次換液時(shí)間對(duì)MEF、REF的影響
            1.3.4 MEF、REF的傳代培養(yǎng)
            1.3.5 MEF、REF細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
            1.3.6 MEF、REF染色
            1.3.7 MEF、REF生長(zhǎng)曲線的繪制
            1.3.8 MEF、REF的凍存與復(fù)蘇
            1.3.9 細(xì)胞計(jì)數(shù)
            1.3.10 統(tǒng)計(jì)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 MEF、REF生物學(xué)特性
        2.2 首次換液時(shí)間對(duì)MEF、REF的影響
        2.3 MEF、REF傳代培養(yǎng)
        2.4 MEF、REF染色結(jié)果
            2.4.1 MEF、REF吉姆薩染色結(jié)果
            2.4.2 MEF、REFHE染色結(jié)果
        2.5 MEF、REF生長(zhǎng)曲線的繪制
        2.6 MEF、REF凍存不同時(shí)間的復(fù)蘇效果
    3 討論
        3.1 鼠、兔胚胎日齡與MEF、REF的關(guān)系
        3.2 首次換液時(shí)間對(duì)MEF、REF的影響
        3.3 MEF、REF的代數(shù)對(duì)細(xì)胞活力及生長(zhǎng)曲線的影響
        3.4 影響MEF、REF凍存、復(fù)蘇的因素
    4 小結(jié)
試驗(yàn)二 飼養(yǎng)層及傳代方法對(duì)兔PGCs體外分離培養(yǎng)的影響
    引言
    1 材料與方法
        1.1 試驗(yàn)材料
            1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物
            1.1.2 主要試劑
            1.1.3 主要儀器設(shè)備
        1.2 主要溶液的配制
            1.2.1 0.2mol/LL-谷氨酰胺存儲(chǔ)液的配制
            1.2.2 1mol/Lβ-巰基乙醇存儲(chǔ)液的配制
            1.2.3 100μg/mL絲裂霉素C的分裝
            1.2.4 FBS的分裝與凍存
            1.2.5 雙抗的分裝與凍存
            1.2.6 明膠的配制
            1.2.7 臺(tái)盼藍(lán)染色液的配制
            1.2.8 PGCs培養(yǎng)液的配制
            1.2.9 胚胎成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液的配制
            1.2.10 消化液的配制
        1.3 試驗(yàn)方法
            1.3.1 兔PGCs分離培養(yǎng)
            1.3.2 兔PGCs的傳代培養(yǎng)
            1.3.3 兔PGCs的鑒定
            1.3.4 不同密度飼養(yǎng)層對(duì)兔PGCs的影響
            1.3.5 不同飼養(yǎng)層對(duì)兔PGCs的影響
            1.3.6 不同分離方法對(duì)兔PGCs的影響
            1.3.7 MEF、REF、混合飼養(yǎng)層活力的檢測(cè)
            1.3.8 不同傳代方法對(duì)兔PGCs的影響
            1.3.9 統(tǒng)計(jì)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 不同日齡兔生殖嵴形態(tài)
        2.2 兔PGCs的形態(tài)鑒定
            2.2.1 兔PGCs的形態(tài)觀察
            2.2.2 兔PGCs生長(zhǎng)行為的觀察
            2.2.3 兔PGCs堿性磷酸酶(AKP)染色
            2.2.4 兔PGCsRT-PCR檢測(cè)
        2.3 不同密度飼養(yǎng)層對(duì)兔PGCs的影響
            2.3.1 兔PGCs在密度為5×104/mL和1×105/mL飼養(yǎng)層上的生長(zhǎng)表現(xiàn)
            2.3.2 兔PGCs在密度為5×105/mL飼養(yǎng)層上的生長(zhǎng)表現(xiàn)
        2.4 不同飼養(yǎng)層對(duì)兔PGCs的影響
            2.4.1 MEF飼養(yǎng)層上兔PGCs的生長(zhǎng)表現(xiàn)
            2.4.2 REF飼養(yǎng)層上兔PGCs的生長(zhǎng)表現(xiàn)
            2.4.3 1:1、2:1、1:2混合飼養(yǎng)層上兔PGCs的生長(zhǎng)表現(xiàn)
        2.5 不同分離方法對(duì)兔PGCs的影響
        2.6 P3代MEF、REF及混合飼養(yǎng)層活力的檢測(cè)
            2.6.1 MTT法檢測(cè)飼養(yǎng)層活力
            2.6.2 臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)MEF、REF、混合飼養(yǎng)層的活力
        2.7 不同傳代方法對(duì)兔PGCs的影響
    3 討論
        3.1 不同胎齡對(duì)兔PGCs的影響
        3.2 不同密度飼養(yǎng)層對(duì)兔PGCs的影響
        3.3 不同飼養(yǎng)層對(duì)兔PGCs的影響
        3.4 不同分離方法對(duì)兔PGCs的影響
        3.5 不同傳代方法對(duì)兔PGCs的影響
    4 小結(jié)
    創(chuàng)新點(diǎn)
試驗(yàn)三 細(xì)胞因子對(duì)兔PGCs分離培養(yǎng)的影響
    引言
    1 材料與方法
        1.1 試驗(yàn)材料
            1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物
            1.1.2 主要試劑
            1.1.3 主要儀器設(shè)備
        1.2 主要溶液的配制
            1.2.1 進(jìn)口FBS的分裝凍存
            1.2.2 細(xì)胞因子的分裝與保存
            1.2.3 兔PGCs培養(yǎng)液的配制
            1.2.4 不同濃度細(xì)胞因子兔PGCs細(xì)胞培養(yǎng)液的配制
        1.3 試驗(yàn)方法
            1.3.1 REF飼養(yǎng)層的制作
            1.3.2 兔PGCs的分離培養(yǎng)
            1.3.3 兔PGCs的鑒定
            1.3.4 不同培養(yǎng)液對(duì)兔PGCs的影響
            1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 兔PGCs生長(zhǎng)行為的觀察
        2.2 兔PGCs堿性磷酸酶(AKP)染色
        2.3 兔PGCsRT-PCR檢測(cè)
        2.4 不同培養(yǎng)液對(duì)兔PGCs的影響
    3 討論
        3.1 血清濃度對(duì)兔PGCs的影響
        3.2 非細(xì)胞因子添加物對(duì)兔PGCs的影響
        3.3 細(xì)胞因子及濃度對(duì)兔PGCs的影響
            3.3.1 LIF
            3.3.2 bFGF
            3.3.3 TGF﹣β1
    4 小結(jié)
    創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
縮寫詞中英對(duì)照表
ABSTRACT
附件



本文編號(hào)：3698290