原始生殖細胞（Primordial germ cells,PGCs）在胚胎和個體發(fā)育過程中,經(jīng)不斷分裂發(fā)育和分化演變?yōu)槌审w動物器官中的精子和卵細胞。體外分離培養(yǎng)兔PGCs是為胚胎早期發(fā)育機理、生殖細胞、細胞疫苗生產(chǎn)、永生化細胞等研究提供大量的細胞。但是,兔PGCs的體外培養(yǎng)方法、傳代方法以及建系仍存在許多問題,影響了兔PGCs細胞的應(yīng)用。兔PGCs體外培養(yǎng)的試驗,除可解決這些問題外,也可為大家畜、實驗動物的相關(guān)研究提供參考。所以建立穩(wěn)定、高效的增殖傳代兔PGCs的方法非常重要。本試驗以兔16-20 d的胚胎為研究對象,比較了其胎齡、飼養(yǎng)層種類、飼養(yǎng)層密度、分離方法、傳代方法及細胞因子等因素對PGCs分離培養(yǎng)的影響。改善兔PGCs體外分離培養(yǎng)的條件,提高兔PGCs集落數(shù)量和質(zhì)量。為建立穩(wěn)定的兔PGCs體外分離培養(yǎng)方法提供參考。試驗主要結(jié)果如下:1.分離培養(yǎng)鼠、兔胚胎成纖維細胞（mouse embryo fibroblast,MEF、rabbit embryo fibroblast,REF）。選取昆明白近交系小鼠12-15 d胎鼠和日本大耳白兔16-18 d胎兔為材料,分離MEF、REF,... 

【文章頁數(shù)】：94 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
文獻綜述
    1 PGCs的起源、發(fā)生
    2 PGCs譜系限定
    3 PGCs的遷移
    4 PGCs的研究進展
        4.1 各種動物PGCs的研究現(xiàn)狀
            4.1.1 人
            4.1.2 兔
            4.1.3 小鼠
            4.1.4 雞
            4.1.5 豬
            4.1.6 牛
            4.1.7 魚
    5 PGCs的生物學(xué)特性
        5.1 PGCs的形態(tài)和生長特性
        5.2 PGCs分化的全能性
    6 PGCs的分離培養(yǎng)
        6.1 PGCs的分離方法
        6.2 PGCs的傳代方法
    7 PGCs的鑒定
        7.1 形態(tài)學(xué)及生長行為鑒定
        7.2 堿性磷酸酶(AKP)染色鑒定
        7.3 發(fā)育全能性標(biāo)志基因的表達
    8 影響PGCs體外分離培養(yǎng)的因素
        8.1 胚胎日齡及獲取PGCs的時間
        8.2 分離培養(yǎng)方法
        8.3 飼養(yǎng)層
            8.3.1 飼養(yǎng)層細胞的種類
            8.3.2 飼養(yǎng)層細胞的代數(shù)和接種密度
        8.4 培養(yǎng)基
        8.5 添加物
            8.5.1 血清
            8.5.2 細胞因子及生長因子
    9 PGCs的意義及應(yīng)用前景
試驗一 鼠、兔胚胎成纖維細胞的分離培養(yǎng)
    引言
    1 材料與方法
        1.1 試驗材料
            1.1.1 試驗動物
            1.1.2 主要試劑
            1.1.3 主要儀器與設(shè)備
        1.2 主要溶液配制
            1.2.1 孕馬血清促性腺激素(PMSG)注射液
            1.2.2 人絨毛膜素性腺激素(HCG)注射液
            1.2.3 1mol/L氫氧化鈉的配制
            1.2.4 1mol/L鹽酸的配制
            1.2.5 PBS緩沖液的配制
            1.2.6 消化液的配制
            1.2.7 胚胎成纖維細胞培養(yǎng)液的配制
            1.2.8 FBS的分裝與凍存
            1.2.9 雙抗的分裝與凍存
            1.2.10 凍存液的配制
        1.3 試驗方法
            1.3.1 試驗動物超排
            1.3.2 MEF、REF的分離培養(yǎng)
            1.3.3 首次換液時間對MEF、REF的影響
            1.3.4 MEF、REF的傳代培養(yǎng)
            1.3.5 MEF、REF細胞形態(tài)學(xué)觀察
            1.3.6 MEF、REF染色
            1.3.7 MEF、REF生長曲線的繪制
            1.3.8 MEF、REF的凍存與復(fù)蘇
            1.3.9 細胞計數(shù)
            1.3.10 統(tǒng)計分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 MEF、REF生物學(xué)特性
        2.2 首次換液時間對MEF、REF的影響
        2.3 MEF、REF傳代培養(yǎng)
        2.4 MEF、REF染色結(jié)果
            2.4.1 MEF、REF吉姆薩染色結(jié)果
            2.4.2 MEF、REFHE染色結(jié)果
        2.5 MEF、REF生長曲線的繪制
        2.6 MEF、REF凍存不同時間的復(fù)蘇效果
    3 討論
        3.1 鼠、兔胚胎日齡與MEF、REF的關(guān)系
        3.2 首次換液時間對MEF、REF的影響
        3.3 MEF、REF的代數(shù)對細胞活力及生長曲線的影響
        3.4 影響MEF、REF凍存、復(fù)蘇的因素
    4 小結(jié)
試驗二 飼養(yǎng)層及傳代方法對兔PGCs體外分離培養(yǎng)的影響
    引言
    1 材料與方法
        1.1 試驗材料
            1.1.1 試驗動物
            1.1.2 主要試劑
            1.1.3 主要儀器設(shè)備
        1.2 主要溶液的配制
            1.2.1 0.2mol/LL-谷氨酰胺存儲液的配制
            1.2.2 1mol/Lβ-巰基乙醇存儲液的配制
            1.2.3 100μg/mL絲裂霉素C的分裝
            1.2.4 FBS的分裝與凍存
            1.2.5 雙抗的分裝與凍存
            1.2.6 明膠的配制
            1.2.7 臺盼藍染色液的配制
            1.2.8 PGCs培養(yǎng)液的配制
            1.2.9 胚胎成纖維細胞培養(yǎng)液的配制
            1.2.10 消化液的配制
        1.3 試驗方法
            1.3.1 兔PGCs分離培養(yǎng)
            1.3.2 兔PGCs的傳代培養(yǎng)
            1.3.3 兔PGCs的鑒定
            1.3.4 不同密度飼養(yǎng)層對兔PGCs的影響
            1.3.5 不同飼養(yǎng)層對兔PGCs的影響
            1.3.6 不同分離方法對兔PGCs的影響
            1.3.7 MEF、REF、混合飼養(yǎng)層活力的檢測
            1.3.8 不同傳代方法對兔PGCs的影響
            1.3.9 統(tǒng)計分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 不同日齡兔生殖嵴形態(tài)
        2.2 兔PGCs的形態(tài)鑒定
            2.2.1 兔PGCs的形態(tài)觀察
            2.2.2 兔PGCs生長行為的觀察
            2.2.3 兔PGCs堿性磷酸酶(AKP)染色
            2.2.4 兔PGCsRT-PCR檢測
        2.3 不同密度飼養(yǎng)層對兔PGCs的影響
            2.3.1 兔PGCs在密度為5×104/mL和1×105/mL飼養(yǎng)層上的生長表現(xiàn)
            2.3.2 兔PGCs在密度為5×105/mL飼養(yǎng)層上的生長表現(xiàn)
        2.4 不同飼養(yǎng)層對兔PGCs的影響
            2.4.1 MEF飼養(yǎng)層上兔PGCs的生長表現(xiàn)
            2.4.2 REF飼養(yǎng)層上兔PGCs的生長表現(xiàn)
            2.4.3 1:1、2:1、1:2混合飼養(yǎng)層上兔PGCs的生長表現(xiàn)
        2.5 不同分離方法對兔PGCs的影響
        2.6 P3代MEF、REF及混合飼養(yǎng)層活力的檢測
            2.6.1 MTT法檢測飼養(yǎng)層活力
            2.6.2 臺盼藍染色法檢測MEF、REF、混合飼養(yǎng)層的活力
        2.7 不同傳代方法對兔PGCs的影響
    3 討論
        3.1 不同胎齡對兔PGCs的影響
        3.2 不同密度飼養(yǎng)層對兔PGCs的影響
        3.3 不同飼養(yǎng)層對兔PGCs的影響
        3.4 不同分離方法對兔PGCs的影響
        3.5 不同傳代方法對兔PGCs的影響
    4 小結(jié)
    創(chuàng)新點
試驗三 細胞因子對兔PGCs分離培養(yǎng)的影響
    引言
    1 材料與方法
        1.1 試驗材料
            1.1.1 試驗動物
            1.1.2 主要試劑
            1.1.3 主要儀器設(shè)備
        1.2 主要溶液的配制
            1.2.1 進口FBS的分裝凍存
            1.2.2 細胞因子的分裝與保存
            1.2.3 兔PGCs培養(yǎng)液的配制
            1.2.4 不同濃度細胞因子兔PGCs細胞培養(yǎng)液的配制
        1.3 試驗方法
            1.3.1 REF飼養(yǎng)層的制作
            1.3.2 兔PGCs的分離培養(yǎng)
            1.3.3 兔PGCs的鑒定
            1.3.4 不同培養(yǎng)液對兔PGCs的影響
            1.3.5 統(tǒng)計分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 兔PGCs生長行為的觀察
        2.2 兔PGCs堿性磷酸酶(AKP)染色
        2.3 兔PGCsRT-PCR檢測
        2.4 不同培養(yǎng)液對兔PGCs的影響
    3 討論
        3.1 血清濃度對兔PGCs的影響
        3.2 非細胞因子添加物對兔PGCs的影響
        3.3 細胞因子及濃度對兔PGCs的影響
            3.3.1 LIF
            3.3.2 bFGF
            3.3.3 TGF﹣β1
    4 小結(jié)
    創(chuàng)新點
參考文獻
縮寫詞中英對照表
ABSTRACT
附件



本文編號：3698290