肌肉生成抑制素（Myostatin,MSTN）是骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的一個(gè)重要的負(fù)調(diào)控因子,是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）超家族的成員之一,具有抑制肌肉分化和生長(zhǎng)的作用。研究表明通過遺傳操作降低MSTN基因的表達(dá)能加速肌肉生長(zhǎng)并增加產(chǎn)肉量。本研究首先構(gòu)建了針對(duì)MSTN基因的TALENs載體,并利用標(biāo)記蛋白表達(dá)載體優(yōu)化了絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞的脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染條件,然后利用最優(yōu)的轉(zhuǎn)染條件將TALENs載體導(dǎo)入阿爾巴斯白絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞中,挑取轉(zhuǎn)染后的單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng),建立單克隆細(xì)胞系,通過PCR鑒定篩選出MSTN+/-和MSTN-/-兩種基因型的細(xì)胞系。選擇MSTN-/-基因型的細(xì)胞通過體細(xì)胞核移植（Somatic cell nuclear transfer, SCNT）的方法制備胚胎,移植受體后生產(chǎn)基因敲除的絨山羊。1、絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞共轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化利用脂質(zhì)體法將紅色熒光蛋白表達(dá)載體pCMV-DsRed質(zhì)粒和綠色熒光蛋白表達(dá)載體pEGFP-C1質(zhì)粒共同導(dǎo)入絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞中,篩選最優(yōu)的轉(zhuǎn)染條件。在轉(zhuǎn)染48h后,倒置熒光顯微鏡下可以觀察到大量表達(dá)紅色熒光和綠色熒光的陽性細(xì)胞并且細(xì)胞生長(zhǎng)狀... 

【文章頁數(shù)】：55 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一部分：實(shí)驗(yàn)部分
    第一章 胎兒成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化
        1 材料
            1.1 化學(xué)試劑與實(shí)驗(yàn)材料
            1.2 主要儀器設(shè)備
        2 方法
            2.1 絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)
            2.2 脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞
            2.3 脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化
        3 結(jié)果
            3.1 山羊胎兒成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)
            3.2 脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化
        4 討論
        參考文獻(xiàn)
    第二章 利用TALENs技術(shù)制備MSTN基因敲除的絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞
        1 材料
            1.1 化學(xué)試劑與實(shí)驗(yàn)材料
            1.2 主要儀器設(shè)備
        2 方法
            2.1 TALENs表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.2 熒光素酶檢測(cè)載體對(duì)靶位點(diǎn)的切割效率
            2.3 TALENs表達(dá)載體的質(zhì)量檢測(cè)
            2.4 脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染阿爾巴斯絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞
            2.5 單克隆細(xì)胞系的獲得
            2.6 單克隆細(xì)胞系基因組的提取
            2.7 陽性單克隆細(xì)胞系的鑒定
            2.8 雙等位基因敲除細(xì)胞系染色體數(shù)目分析
        3 結(jié)果
            3.1 TALENs表達(dá)載體的構(gòu)建
            3.2 熒光素酶檢測(cè)結(jié)果
            3.3 TALENs表達(dá)載體的質(zhì)量檢測(cè)
            3.4 單克隆細(xì)胞系的獲得
            3.5 陽性單克隆細(xì)胞系的鑒定
            3.6 雙敲細(xì)胞系的染色體數(shù)目分析
        4 討論
        參考文獻(xiàn)
    第三章 MSTN基因敲除細(xì)胞系的核移植
        1 材料
            1.1 化學(xué)試劑與實(shí)驗(yàn)材料
            1.2 主要儀器設(shè)備
        2 方法
            2.1 卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)
            2.2 供體細(xì)胞的準(zhǔn)備
            2.3 核移植
            2.4 電融合
            2.5 重構(gòu)胚的激活
            2.6 克隆胚胎的體外培養(yǎng)
            2.7 克隆胚胎移植及妊娠檢查
        3 結(jié)果
            3.1 供體細(xì)胞的比較
            3.2 MSTN~(-/-)克隆胚胎的發(fā)育能力檢測(cè)
            3.3 克隆胚胎移植及妊娠檢查
        4 討論
        參考文獻(xiàn)
    結(jié)論
第二部分：綜述部分
    參考文獻(xiàn)
致謝
碩士期間論文發(fā)表情況


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]不同激活方法對(duì)絨山羊卵母細(xì)胞孤雌發(fā)育的影響[J]. 金永,袁建龍,朱兵,郭旭東,劉東軍.  農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2011(03)
[3]奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)及脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染研究[J]. 張艷麗,許丹,龐訓(xùn)勝,萬永杰,王子玉,孟立,宋輝,王鋒.  南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2010(01)
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[7]以不同類型的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為核供體生產(chǎn)牛的轉(zhuǎn)基因克隆胚胎[J]. 龔國(guó)春,戴蘊(yùn)平,樊寶良,朱化彬,王海平,王莉莉,方昌閣,萬榮,劉穎,李榮,李寧.  中國(guó)科學(xué)（C輯:生命科學(xué)）. 2003(06)



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