副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis, HPS）是豬群上呼吸道的條件性致病菌,在特定條件下可以引起以纖維素性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征的副豬嗜血桿菌病。HPS中wza基因編碼的莢膜多糖輸出蛋白在病原菌的致病過(guò)程中發(fā)揮重要的作用,本課題研究了HPS中莢膜多糖輸出蛋白對(duì)其粘附及抗吞噬能力的影響,為闡明副豬嗜血桿菌定殖和擴(kuò)散的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。本課題主要取得的研究成果如下所示： 1、HPS莢膜多糖輸出蛋白相關(guān)基因wza缺失株的構(gòu)建 通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增wza基因的上下游同源臂片斷,同時(shí)在上游同源臂5’端引物的和下游同源臂的3’端引物添加USS序列（ACCGCTTGT）,再擴(kuò)增卡那抗性基因表達(dá)盒,將這三個(gè)片段用重疊PCR的方法拼接后,連接到自然轉(zhuǎn)化載體pK18mobsacB得到重組質(zhì)粒pK18-wza-UKD。將重組質(zhì)粒自然轉(zhuǎn)化入HPS FX0103中,通過(guò)kan抗性篩選得到wza基因缺失突變株FX0103-△wza,并對(duì)突變株用PCR、 RT-PCR、Southern Blot及Western Blot進(jìn)行了鑒定。 2、HPS野生株FX0103與缺失... 

【文章頁(yè)數(shù)】：68 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 副豬嗜血桿菌研究進(jìn)展
        1.1.1 副豬嗜血桿菌
        1.1.2 副豬嗜血桿菌流行病學(xué)
        1.1.3 副豬嗜血桿菌功能基因
    1.2 莢膜多糖的研究進(jìn)展
        1.2.1 莢膜多糖的結(jié)構(gòu)及組成
        1.2.2 莢膜多糖與細(xì)菌的粘附相關(guān)
        1.2.3 莢膜多糖與細(xì)菌的抗吞噬相關(guān)
2 研究的目的與意義
3 材料與方法
    3.1 試驗(yàn)材料
        3.1.1 菌株、質(zhì)粒載體和細(xì)胞
        3.1.2 酶、試劑、試劑盒
        3.1.3 培養(yǎng)基及抗生素的配制
        3.1.4 引物
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 副豬嗜血桿菌基因組DNA的提取
        3.2.2 自殺性質(zhì)粒pK18-wza-UKD的構(gòu)建
        3.2.3 將自殺性質(zhì)粒pK18-wza-UKD自然轉(zhuǎn)化入副豬嗜血桿菌
        3.2.4 wza基因缺失突變株的鑒定
        3.2.5 生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定
        3.2.6 透射電子顯微鏡觀察細(xì)菌的莢膜
        3.2.7 檢測(cè)副豬嗜血桿菌FX0103和FX0103-△wza的莢膜多糖表達(dá)情況
        3.2.8 FX0103和FX0103-△wza的血清分型試驗(yàn)
        3.2.9 FX0103和FX0103-△wza與PK-15細(xì)胞作用后粘附能力的比較
        3.2.10 小鼠單核巨噬細(xì)胞對(duì)FX0103和FX0103-△wza吞噬能力的比較
        3.2.11 FX0103與FX0103-△wza被小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬后存活能力的比較
4 結(jié)果與分析
    4.1 自然轉(zhuǎn)化法篩選wza基因缺失突變株
        4.1.1 自殺性質(zhì)粒pK18-wza-UKD的構(gòu)建
        4.1.2 重組質(zhì)粒pK18-wza-UKD自然轉(zhuǎn)化入副豬嗜血桿菌
    4.2 wza基因缺失突變株的鑒定
        4.2.1 wza基因缺失突變株的PCR鑒定
        4.2.2 wza基因缺失突變株的Southern Blot鑒定
        4.2.3 RT-PCR檢測(cè)極性效應(yīng)
        4.2.4 wza基因缺失突變株的Western Blot鑒定
    4.3 野生株FX0103與基因缺失突變株FX0103-△wza生長(zhǎng)曲線(xiàn)的繪制
    4.4 透射電子顯微鏡觀察細(xì)菌莢膜的形態(tài)
    4.5 副豬嗜血桿菌FX0103和FX0103-△wza多糖的表達(dá)
        4.5.1 副豬嗜血桿菌FX0103和FX0103-△wza總多糖的提取
        4.5.2 副豬嗜血桿菌FX0103和FX0103-△wza胞外多糖的提取
    4.6 FX0103和FX0103-△wza的血清分型試驗(yàn)
    4.7 FX0103和FX0103-△wza與PK-15細(xì)胞作用后粘附能力的比較
    4.8 FX0103和FX0103-△wza與小鼠單核巨噬細(xì)胞作用后抗吞噬能力的比較
    4.9 FX0103和FX0103-△wza在小鼠單核巨噬細(xì)胞內(nèi)存活能力的比較
5 討論
    5.1 自然轉(zhuǎn)化法篩選副豬嗜血桿菌中wza基因缺失突變株
    5.2 野生株與wza基因缺失突變株的生物學(xué)特性的比較
    5.3 野生株和wza基因缺失突變株與豬腎上皮細(xì)胞(PK-15)的粘附能力
    5.4 野生株和缺失株與小鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW264.7)的相互作用
6 小結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3694611