發(fā)布時(shí)間：2022-10-19 10:05

　　豬非典型瘟病毒（Atypical porcine pestivirus,APPV）是A-II型先天性震顫（Congenital tremor,CT）的主要病原體,主要引起新引進(jìn)后備母豬所生產(chǎn)的第一窩仔豬震顫性疾病,臨床癥狀表現(xiàn)為全身或者局部肌肉痙攣收縮并伴有共濟(jì)失調(diào)。自2015年APPV首次在美國(guó)報(bào)道以來,迄今已經(jīng)在全世界15個(gè)國(guó)家流行,給全球養(yǎng)豬業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。為研究APPV的遺傳進(jìn)化關(guān)系,本研究開展了中國(guó)部分地區(qū)APPV流行病學(xué)調(diào)查,進(jìn)行了 APPV密碼子使用模式分析。Npro是瘟病毒基因組翻譯產(chǎn)生的第一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白,對(duì)病毒具有重要的生物學(xué)功能。該蛋白具有半胱氨酸蛋白酶活性,能夠?qū)⑵鋸姆g后的病毒多聚蛋白上自剪切出來,并進(jìn)一步發(fā)揮病毒拮抗宿主天然免疫的作用。豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒在感染宿主后能抑制機(jī)體的天然免疫反應(yīng),從而導(dǎo)致病毒的免疫逃逸和持續(xù)性感染。已有研究表明,Npro蛋白在這方面起到重要作用。然而,APPV作為新發(fā)現(xiàn)的瘟病毒,其Npro蛋白是否具有自剪切活性有待確定。同時(shí),APPV的致病和免疫抑制機(jī)理均不清楚,解析Npro蛋白在天然免疫方面的作用將有助于闡述這些問題... 

【文章頁(yè)數(shù)】：100 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語(yǔ)表
文獻(xiàn)綜述
    1 先天性震顫概述
    2 APPV的分子生物學(xué)特征及研究進(jìn)展
        2.1 APPV分類
        2.2 APPV的生物學(xué)特性
        2.3 APPV的基因組結(jié)構(gòu)
        2.4 APPV的主要蛋白
        2.5 病毒的進(jìn)化
        2.6 流行病學(xué)
        2.7 傳播途徑
        2.8 APPV感染的免疫學(xué)特征
        2.9 臨床癥狀和病理變化
        2.10 組織嗜性
        2.11 診斷
    3 研究目的及意義
研究?jī)?nèi)容
    第一章 APPV的分離鑒定及序列分析
        1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 病料
            1.2 主要試劑
            1.3 主要試劑的配制
            1.4 主要儀器與設(shè)備
        2 試驗(yàn)方法
            2.1 引物設(shè)計(jì)
            2.2 感受態(tài)細(xì)胞top 10的制備
            2.3 病料處理
            2.4 RNA的提取
            2.5 cDNA的制備
            2.6 病毒檢測(cè)及全基因組序列擴(kuò)增
            2.7 PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)及回收純化
            2.8 DNA連接
            2.9 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化
            2.10 重組質(zhì)粒的提取及鑒定
            2.11 測(cè)序及進(jìn)化分析
        3 結(jié)果
            3.1 APPV檢測(cè)結(jié)果
            3.2 APPV在中國(guó)的地理分布
            3.3 基于APPV-ORF,N~(pro)和E2基因的系統(tǒng)發(fā)育分析
        4 討論
        5 小結(jié)
    第二章 APPV密碼子使用模式分析
        1 實(shí)驗(yàn)材料
        2 試驗(yàn)方法
            2.1 重組分析和系統(tǒng)發(fā)育分析
            2.2 主成分分析
            2.3 成分和主要參數(shù)分析
            2.4 相對(duì)二核苷酸豐度分析
            2.5 相對(duì)同義密碼子使用值
            2.6 有效密碼子數(shù)分析
            2.7 ENC繪圖分析
            2.8 中性分析
            2.9 偏倚分析
        3 結(jié)果
            3.1 重組分析、系統(tǒng)發(fā)育分析和主成分分析
            3.2 APPV的核苷酸組成
            3.3 RSCU分析
            3.4 相對(duì)二核苷酸豐度分析
            3.5 ENC分析
            3.6 ENC-plot關(guān)聯(lián)分析
            3.7 中性分析
            3.8 PR2分析
        4 討論
        5 小結(jié)
    第三章 APPV-Npro蛋白自剪切活性的研究
        1 材料
            1.1工具酶及主要試劑
            1.2 細(xì)胞、菌株及質(zhì)粒載體
            1.3 主要試劑的配制
            1.4 主要儀器與設(shè)備
        2 試驗(yàn)方法
            2.1 引物的試劑與合成
            2.2 目的片段的擴(kuò)增
            2.3 載體與目的片段雙酶切
            2.4 重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.5 重組質(zhì)粒的提取與鑒定
            2.6 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染
            2.7 蛋白樣品的收集和制備
            2.8 Western Blot檢測(cè)
        3 結(jié)果
            3.1 鑒定重組質(zhì)粒
            3.2 APPV-N~(pro)蛋白具有自剪切活性
            3.3 剪切位點(diǎn)突變對(duì)N~(pro)蛋白剪切活性的影響
            3.4 關(guān)鍵氨基酸突變對(duì)N~(pro)蛋白剪切活性的影響
            3.5 APPV-N~(pro)蛋白N端截短對(duì)N~(pro)蛋白剪切活性的影響
            3.6 APPV-N~(pro)蛋白C端截短對(duì)N~(pro)蛋白剪切活性的影響
        4 討論
        5 小結(jié)
    第四章 APPV-Npro蛋白通過IRF3抑制IFN-β的產(chǎn)生
        1 材料
            1.1 工具酶及主要試劑
            1.2 細(xì)胞、菌株及質(zhì)粒載體
            1.3 主要儀器與設(shè)備
        2 試驗(yàn)方法
            2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建
            2.2 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染
            2.3 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄
            2.4 定量PCR檢測(cè)
            2.5 啟動(dòng)子報(bào)告基因的檢測(cè)
            2.6 免疫共沉淀(Co-IP)
            2.7 Western blot檢測(cè)
            2.8 間接免疫熒光
            2.9 哺乳動(dòng)物細(xì)胞雙雜交
            2.10 數(shù)據(jù)分析
        3 結(jié)果
            3.1 APPV-N~(pro)蛋白對(duì)IFN-β產(chǎn)生的抑制
            3.2 多種天然免疫基因刺激下APPV-Npro蛋白對(duì)IRF3啟動(dòng)子活性的抑制
            3.3 APPV-N~(pro)蛋白與IRF3蛋白的相互作用
        4 討論
        5 小結(jié)
全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄一: APPV全長(zhǎng)基因組序列詳細(xì)信息
附錄二: APPV-Npro蛋白基因序列詳細(xì)信息
附錄三: APPV-E2蛋白基因序列詳細(xì)信息
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]一起豬非典型瘟病毒感染的診斷[J]. 周可磊,陳新諾,岳華,張斌.  動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2019(06)
[2]基于Erns蛋白的豬非典型瘟病毒間接ELISA檢測(cè)方法的建立[J]. 黎振標(biāo),任旭皎,劉健新,魯榮,李慧子,張彭濤,寧章勇.  中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào). 2020(03)
[3]基于豬非典型瘟病毒E2蛋白的間接ELISA檢測(cè)方法的建立[J]. 黎振標(biāo),許古明,劉健新,任旭皎,魯榮,李慧子,張彭濤,寧章勇.  中國(guó)獸醫(yī)科學(xué). 2019(01)



本文編號(hào)：3693160