旨在研究β-酪蛋白（β-casein,CSN2）對(duì)奶山羊泌乳性能的影響,利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞（GFFs）CSN2基因,為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型構(gòu)建提供核供體。針對(duì)CSN2第二號(hào)、八號(hào)外顯子設(shè)計(jì)5個(gè)靶向CSN2基因sg RNA（T1、T2、T3、E1和E2）,與PX330-e GFP載體連接,構(gòu)建PX330-e GFP-sg RNA敲除表達(dá)載體,經(jīng)T7E I酶切實(shí)驗(yàn)評(píng)估敲除效率;選擇第八號(hào)外顯子敲除效率最高sg RNA,構(gòu)建PX330-Neo-sg RNA敲除載體,將PX330-e GFP-sg RNA T及PX330-e GFP-sgRNAE與PX330-Neo-sgRNAE組合轉(zhuǎn)染細(xì)胞,經(jīng)流式分選、G418藥篩獲得敲除CSN2基因細(xì)胞。Western blot測(cè)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞CSN2表達(dá)情況。測(cè)序結(jié)果表明各sgRNA均正確連入PX330表達(dá)載體中,T7E 1酶切實(shí)驗(yàn)表明sg RNA T1、sgRNAE2敲除效率最高達(dá)34.9%和25.9%;經(jīng)熒光定量PCR及免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明,eGFP+Neo轉(zhuǎn)染組CSN2敲除細(xì)胞比例顯著高于e GFP+e GFP轉(zhuǎn)染組（P＜... 

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 儀器
        1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料
    1.2 方法
        1.2.1 靶位點(diǎn)sg RNA的選擇
        1.2.2 載體構(gòu)建
        1.2.3 敲除效率鑒定
        1.2.4 Western blot檢測(cè)
        1.2.5 PX330-Neo-sg RNA質(zhì)粒構(gòu)建及共轉(zhuǎn)染
        1.2.6 熒光定量PCR
        1.2.7 細(xì)胞免疫熒光染色
2 結(jié)果
    2.1 PX330-e GFP-sg RNA載體構(gòu)建
    2.2 敲除效率鑒定
    2.3 Western blot檢測(cè)
    2.4 PX330-Neo-sg RNA載體構(gòu)建
    2.5 長(zhǎng)片段CSN2敲除細(xì)胞篩選
    2.6 熒光定量PCR檢測(cè)
    2.7 免疫熒光檢測(cè)
3 討論
4 結(jié)論



本文編號(hào)：3692684