我國蛋白質(zhì)飼料資源供求矛盾突出。每年產(chǎn)生大量羽、毛和蹄角等角蛋白資源,這些角蛋白富含二硫鍵、氫鍵及疏水基團(tuán),結(jié)構(gòu)穩(wěn)定不易被動(dòng)物消化利用。物理、化學(xué)方法處理角蛋白存在能耗高、氨基酸破壞嚴(yán)重和環(huán)境污染等缺陷。高效生物降解更符合未來發(fā)展需求,打開二硫鍵,破壞角蛋白疏水結(jié)構(gòu)是生物水解角蛋白的關(guān)鍵,實(shí)現(xiàn)打開這些化學(xué)鍵關(guān)鍵酶的高效表達(dá)對角蛋白生物處理產(chǎn)業(yè)化至關(guān)重要。本研究擬通過對地衣芽孢桿菌CP-16誘變（物理和化學(xué)）育種篩選獲得具有高降解角蛋白效率正突變菌,為高效水解角蛋白奠定基礎(chǔ)。同時(shí),從CP-16中擴(kuò)增出二硫鍵還原酶基因（Trx）、角蛋白酶基因（Ker）,構(gòu)建獲得2株枯草芽胞桿菌WB600降解羽毛關(guān)鍵酶重組菌（B.subtilis WB600/pSTOP 1622-pTrx、B.subtilis WB600/pSTOP 1622-pKer）。并分析不同信號肽對目的基因（Trx、Ker）分泌影響,隨后對重組菌進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化,實(shí)現(xiàn)CP-16降解角蛋白關(guān)鍵酶量產(chǎn),并應(yīng)用于角蛋白生物酶解中。運(yùn)用紫外、硫酸二乙酯對原始菌進(jìn)行多輪物理和化學(xué)誘變,經(jīng)初篩與復(fù)篩得到了羽毛降解關(guān)鍵酶高產(chǎn)正突變菌。經(jīng)紫外誘變... 

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
英文縮略表
第一章 引言
    1.1 角蛋白
        1.1.1 角蛋白組成與結(jié)構(gòu)
        1.1.2 角蛋白利用
    1.2 角蛋白降解關(guān)鍵酶
        1.2.1 角蛋白酶
        1.2.2 二硫鍵還原酶
    1.3 傳統(tǒng)微生物誘變育種
        1.3.1 紫外誘變
        1.3.2 化學(xué)誘變
        1.3.3 篩選方法
    1.4 枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)
        1.4.1 枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究現(xiàn)狀
    1.5 影響外源蛋白在枯草芽孢桿菌分泌表達(dá)關(guān)鍵因素
        1.5.1 啟動(dòng)子選擇
        1.5.2 高效信號肽篩選
        1.5.3 前導(dǎo)肽改造
        1.5.4 制備缺陷型宿主菌
        1.5.5 構(gòu)建枯草芽孢桿菌-大腸桿菌穿梭系統(tǒng)
        1.5.6 提高載體與感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率
    1.6 研究目的與意義
    1.7 技術(shù)路線
第二章 地衣芽孢桿菌CP-16 誘變選育
    2.1 材料與方法
        2.1.1 菌種
        2.1.2 培養(yǎng)基和主要化學(xué)試劑的配制
        2.1.3 主要儀器設(shè)備
        2.1.4 菌株復(fù)蘇和種子液制備
        2.1.5 地衣芽孢桿菌CP-16 紫外誘變
        2.1.6 地衣芽孢桿菌CP-16 化學(xué)誘變
        2.1.7 初篩
        2.1.8 復(fù)篩
        2.1.9 致死率計(jì)算
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 紫外線對菌株的誘變效應(yīng)
        2.2.2 紫外誘變的初篩與復(fù)篩
        2.2.3 硫酸二乙酯對菌株的誘變效應(yīng)
        2.2.4 硫酸二乙酯誘變的初篩與復(fù)篩
    2.3 討論
    2.4 小結(jié)
第三章 CP-16 羽毛降解關(guān)鍵基因枯草芽孢桿菌中的表達(dá)
    3.1 材料與方法
        3.1.1 菌株和載體
        3.1.2 工具酶和試劑
        3.1.3 培養(yǎng)基和主要化學(xué)試劑的配制
        3.1.4 主要儀器設(shè)備
        3.1.5 降解羽毛關(guān)鍵酶基因序列的克隆
        3.1.6 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
        3.1.7 菌液PCR與基因測序
        3.1.8 重組質(zhì)粒的小量提取及酶切鑒定
        3.1.9 枯草芽孢桿菌WB600 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化
        3.1.10 菌液PCR與基因測序
        3.1.11 酶活測定
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 CP-16 基因組DNA提取
        3.2.2 降解羽毛關(guān)鍵酶基因的克隆
        3.2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.2.4 重組菌株的表達(dá)
    3.3 討論
    3.4 小結(jié)
第四章 降解羽毛關(guān)鍵基因高效信號肽篩選
    4.1 材料與方法
        4.1.1 菌株和載體
        4.1.2 不同信號肽降解羽毛關(guān)鍵酶基因序列的克隆
        4.1.3 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
        4.1.4 菌液PCR與基因測序
        4.1.5 枯草芽孢桿菌WB600 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化
        4.1.6 菌液PCR與基因測序
        4.1.7 酶活測定
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 無信號肽角蛋白酶基因的克隆
        4.2.2 無信號肽角蛋白酶基因重組枯草芽孢桿菌的表達(dá)分析
        4.2.3 含有不同信號肽二硫鍵還原酶、角蛋白酶基因的克隆
        4.2.4 含有不同信號肽二硫鍵還原酶、角蛋白酶基因重組表達(dá)分析
        4.2.5 二硫鍵還原酶、角蛋白酶酶活性的測定
    4.3 討論
    4.4 小結(jié)
第五章 重組菌發(fā)酵條件優(yōu)化
    5.1 材料與方法
        5.1.1 菌種
        5.1.2 種子液制備
        5.1.3 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對重組菌產(chǎn)酶影響
        5.1.4 重組菌碳源優(yōu)化
        5.1.5 不同碳源組合對重組菌產(chǎn)酶的影響
        5.1.6 重組菌氮源優(yōu)化
        5.1.7 不同氮源組合對重組菌產(chǎn)酶的影響
        5.1.8 發(fā)酵時(shí)間對重組菌產(chǎn)酶的影響
        5.1.9 正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)配方
    5.2 結(jié)果與分析
        5.2.1 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對重組菌產(chǎn)酶影響
        5.2.2 重組菌碳源優(yōu)化
        5.2.3 不同碳源組合對重組菌產(chǎn)酶的影響
        5.2.4 不同碳源組合添加對重組菌產(chǎn)酶影響正交試驗(yàn)驗(yàn)證
        5.2.5 重組菌氮源優(yōu)化
        5.2.6 不同氮源組合添加對重組菌產(chǎn)酶影響
        5.2.7 不同氮源組合添加對重組菌產(chǎn)酶影響正交試驗(yàn)驗(yàn)證
        5.2.8 發(fā)酵時(shí)間對重組菌產(chǎn)酶的影響
        5.2.9 正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)配方
        5.2.10 正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)配方結(jié)果驗(yàn)證
    5.3 討論
    5.4 小結(jié)
第六章 全文結(jié)論
    6.1 主要結(jié)論
    6.2 創(chuàng)新點(diǎn)
    6.3 有待進(jìn)一步解決的問題
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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[6]玉米赤霉烯酮降解酶基因表達(dá)的啟動(dòng)子優(yōu)化研究[D]. 周艷敬.河南工業(yè)大學(xué) 2015
[7]地衣芽孢桿菌CP-16降解羽毛角蛋白相關(guān)蛋白酶的分離、表達(dá)和相互關(guān)系[D]. 王德山.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2014
[8]高二硫鍵還原能力角蛋白降解菌的研究[D]. 齊志國.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2012
[9]全基因組預(yù)測Phenylobacterium zucineum HLK1T的外排蛋白[D]. 嚴(yán)智宇.浙江大學(xué) 2008
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本文編號：3692573