隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展,體細(xì)胞克隆作為一種技術(shù)手段已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、物種保護(hù)、家畜繁育、異種器官移植以及疾病模型的研究,但是克隆效率低下一直阻礙這一技術(shù)發(fā)展。一般認(rèn)為克隆效率低下與重構(gòu)胚不正確或者不完全的重組而導(dǎo)致的錯(cuò)誤表觀修飾相關(guān),其中最主要的就是DNA甲基化異常和組蛋白修飾錯(cuò)誤。因此如何提高克隆效率對(duì)推動(dòng)這一技術(shù)發(fā)展有著重要的意義。 1.徒手克隆技術(shù)的優(yōu)化 為提高徒手克隆效率,我們?cè)谕绞挚寺∵^程中對(duì)克隆胚重構(gòu)以及胚胎移植都進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的囊胚率能達(dá)到40%左右,并將235枚桑椹胚及囊胚移植到3頭自然發(fā)情后4到5天的受體母豬子宮角內(nèi),并使兩頭受體母豬成功懷孕,雖然1頭母豬中途不幸流產(chǎn),但另1頭母豬在妊娠后第114天自然分娩產(chǎn)下8只小豬,相對(duì)與其他實(shí)驗(yàn)室的克隆產(chǎn)子率明顯提高。 2.卵母細(xì)胞成熟過程及孤雌激活后胚胎發(fā)育中Tet1的免疫熒光染色 實(shí)驗(yàn)選取成熟0h（GV）、12h、24h、36h和MⅡ時(shí)期脫完卵丘的卵母細(xì)胞以及孤雌激活（物理+化學(xué)）后7.5h、12h、15h、24h和2-cell（36h）胚胎用PFA固定后進(jìn)行免疫熒光染色。結(jié)果發(fā)... 

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
目錄
摘要
ABSTRACT
英文縮略詞表(ABBREVIATION)
第一章 文獻(xiàn)綜述
    綜述1、影響體細(xì)胞核移植效率的因素
        1.1 卵巢及其來源
            1.1.1 卵巢受來源母豬品種、年齡影響
            1.1.2 季節(jié)變化與卵巢
            1.1.3 卵巢受采集時(shí)間和溫度影響
        1.2 供體細(xì)胞
        1.3 徒手克隆的流程與注意事項(xiàng)
        1.4 受體母豬與胚胎移植
        參考文獻(xiàn)
    綜述2 5-aza-CdR在體細(xì)胞核移植中的應(yīng)用及甲基化相關(guān)基因的研究
        2.1 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的基本作用與特征
        2.2 5-aza-CdR對(duì)胚胎發(fā)育的影響
        2.3 Tet蛋白家族的結(jié)構(gòu)與功能
        2.4 Tet蛋白家族的生物學(xué)作用
        2.5 Dnmts與Tet蛋白家族關(guān)系
        參考文獻(xiàn)
第二章 實(shí)驗(yàn)研究
    第一節(jié) 徒手克隆技術(shù)的優(yōu)化
        1 材料與方法
            1.1 實(shí)驗(yàn)材料
                1.1.1 儀器
                1.1.2 主要耗材
                1.1.3 溶液配制
                1.1.4 供體細(xì)胞
            1.2 試驗(yàn)方法
                1.2.1 卵巢的采集及處理
                1.2.2 卵母細(xì)胞體外成熟
                1.2.3 徒手克隆前準(zhǔn)備
                1.2.4 脫卵丘
                1.2.5 供體細(xì)胞準(zhǔn)備
                1.2.6 徒手體細(xì)胞核移植技術(shù)
                1.2.7 胚胎移植
                1.2.8 妊娠診斷
        2 結(jié)果
            2.1 克隆胚胎的生產(chǎn)
            2.2 豬克隆胚胎移植
            2.3 妊娠診斷結(jié)果
            2.4 懷孕母豬的分娩
        3 分析與討論
            3.1 胚胎構(gòu)建及其胚胎發(fā)育
            3.2 關(guān)于胚胎移植
            3.3 關(guān)于徒手克隆操作
        參考文獻(xiàn)
    第二節(jié) Tet1在早期胚胎發(fā)育中的變化
        1 材料與方法
            1.1 材料
                1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
                1.1.2 試劑
                1.1.3 儀器
                1.1.4 溶液配制
            1.2 方法
                1.2.1 卵巢的采集同第一節(jié)
                1.2.2 卵母細(xì)胞體外成熟同第一節(jié)
                1.2.3 卵母細(xì)胞的處理
                1.2.4 冷凍細(xì)胞的復(fù)蘇及培養(yǎng)
                1.2.5 胎兒成纖維細(xì)胞的處理
                1.2.6 細(xì)胞RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄
                1.2.7 引物設(shè)計(jì)與合成
                1.2.8 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)
                1.2.9 統(tǒng)計(jì)分析
                1.2.10 卵母細(xì)胞孤雌激活
                1.2.11 間接免疫熒光染色技術(shù)
        2 結(jié)果
            2.1 卵母細(xì)胞成熟及PA早期發(fā)育過程中不同時(shí)期Tet1的間接免疫熒光染色
            2.2 5-aza-CdR處理對(duì)卵母細(xì)胞成熟過程中甲基化相關(guān)基因表達(dá)的影響
            2.3 5-aza-CdR處理對(duì)豬胎兒成纖維細(xì)胞甲基化相關(guān)基因的表達(dá)影響
        3 分析與討論
            3.1 Tet1在卵母細(xì)胞成熟過程中及PA后胚胎早期發(fā)育過程中的探索
            3.2 5-aza-CdR與Dnmts相關(guān)基因的的探討
            3.3 5-aza-CdR與Tet蛋白家族相關(guān)基因的的探討
        參考文獻(xiàn)
全文結(jié)論
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3690902