早期斷奶是仔豬生長(zhǎng)過程中重大的創(chuàng)傷性事件,斷奶應(yīng)激和飼糧的改變引起腸道功能紊亂、腸道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境失衡和生長(zhǎng)受阻,乳源生長(zhǎng)因子的缺乏是引起腸道發(fā)育受阻的主要原因之一。表皮生長(zhǎng)因子（Epidermal growth factor, EGF）是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、代謝、存活、凋亡等的一種重要生長(zhǎng)因子,是初乳和常乳中最重要的生長(zhǎng)因子之一。已有研究表明食品級(jí)乳酸乳球菌（Lactococcus lactis, L. lactis）的NICE表達(dá)系統(tǒng)在外源蛋白的表達(dá)中性能優(yōu)越。本研究旨在通過乳酸乳球菌作為載體構(gòu)建表達(dá)功能蛋白豬EGF （pEGF）,獲得具有生物學(xué)活性的重組pEGF,并探索乳酸乳球菌和特異性功能蛋白pEGF的雙重效應(yīng)結(jié)合在早期斷奶仔豬生產(chǎn)中應(yīng)用的可行性。本研究包括以下三部分： 試驗(yàn)一豬表皮生長(zhǎng)因子（pEGF）成熟蛋白編碼區(qū)的克隆及序列分析 本試驗(yàn)通過克隆豬egf基因成熟肽編碼序列,并與USP45蛋白的信號(hào)肽編碼序列形成融合片段,通過TA克隆獲得pMD19-SPUsp45-MPpEGF質(zhì)粒,經(jīng)過菌液PCR分析、雙酶切鑒定和測(cè)序鑒定USP45蛋白的信號(hào)肽編碼序列和pegf基... 

【文章頁(yè)數(shù)】：132 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮寫詞表
目錄
前言
第一部分 文獻(xiàn)綜述
    1. 斷奶應(yīng)激對(duì)仔豬腸道發(fā)育的影響
        1.1 自然斷奶
        1.2 早期斷奶
        1.3 斷奶對(duì)仔豬腸道形態(tài)發(fā)育的影響
        1.4 斷奶對(duì)仔豬腸道消化酶分泌及活性的影響
        1.5 斷奶對(duì)仔豬腸道微生物的影響
    2. EGF及其在腸道的穩(wěn)定性和生物學(xué)功能
        2.1 EGF
        2.2 EGF在胃腸道的穩(wěn)定性
        2.3 EGF受體
        2.4 EGFR在腸道的分布
        2.5 EGF在胃腸道的生物學(xué)功能
    3 乳酸乳球菌在基因工程中的應(yīng)用
        3.1 乳酸菌
        3.2 乳酸乳球菌及其在胃腸道的功能
        3.3 乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)
        3.4 NICE表達(dá)系統(tǒng)
            3.4.1 Nisin的分子結(jié)構(gòu)
            3.4.2 Nisin的生物合成
            3.4.3 NICE系統(tǒng)的表達(dá)調(diào)控機(jī)制
            3.4.4 NICE系統(tǒng)常用的細(xì)菌和質(zhì)粒
            3.4.5 NICE表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用
第二部分 研究的目的、意義、內(nèi)容與技術(shù)路線
    1 研究目的
    2 研究意義
    3 研究的內(nèi)容
    4 技術(shù)路線
第三部分 試驗(yàn)研究
    試驗(yàn)一 豬表皮生長(zhǎng)因子(pEGF)成熟蛋白編碼區(qū)的克隆及序列分析
        1 引言
        2 材料與方法
            2.1 試驗(yàn)材料
                2.1.1 組織樣品采集
                2.1.2 菌株和質(zhì)粒
                2.1.3 主要試劑
                2.1.4 主要試劑的配制
                2.1.5 主要儀器設(shè)備
            2.2 試驗(yàn)方法
                2.2.1 總RNA提取
                2.2.2 RT-PCR
                2.2.3 PCR擴(kuò)增
                2.2.4 pMD19-SPUsp45-MPpEGF的構(gòu)建
                2.2.5 E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備
                2.2.6 E. coli DH5α的轉(zhuǎn)化
                2.2.7 挑選陽(yáng)性克隆
                2.2.8 大腸桿菌的質(zhì)粒提取
                2.2.9 pMD19-SPUsp45-MPpEGF重組質(zhì)粒的鑒定
        3 試驗(yàn)結(jié)果與分析
            3.0 腎臟總RNA的提取
            3.1 SPUsp45-MPpEGF融合片段的擴(kuò)增
            3.2 重組質(zhì)粒pMD19-SPUsp45-MPpEGF的構(gòu)建
                3.2.1 重組質(zhì)粒pMD19-SPUsp45-MPpEGF的菌液PCR鑒定
                3.2.2 重組質(zhì)粒pMD19-SPUsp45-MPpEGF的雙酶切鑒定
                3.2.3 重組質(zhì)粒pMD19-SPUsp45-MPpEGF的測(cè)序鑒定
        4 討論
        5 小結(jié)
    試驗(yàn)二：pEGF在Lactococcus lactis NZ9000中的分泌表達(dá)及活性鑒定
        1 引言
        2 試驗(yàn)材料和方法
            2.1 細(xì)菌、細(xì)胞及來源
            2.2 主要試劑
            2.3 主要試劑的配制
            2.4 主要儀器設(shè)備
            2.5 試驗(yàn)方法
                2.5.1 pMD19-SPUsp45-MPpEGF重組質(zhì)粒的抽提
                2.5.2 pMD19-SPUsp45-MPpEGF質(zhì)粒與表達(dá)載體pNZ8148雙酶切
                2.5.3 DNA片段的連接
                2.5.4 E.coli MC1061感受態(tài)細(xì)胞的制備
                2.5.5 轉(zhuǎn)化E. coli MC1061感受態(tài)細(xì)胞
                2.5.6 E. coli MC1061/pNZ8148-SPUsp45-MPpEGF質(zhì)粒的提取
                2.5.7 pNZ8148-Usp45-MPpEGF重組質(zhì)粒的鑒定
                2.5.8 E.coli質(zhì)粒的提取
                2.5.9 乳酸乳球菌NZ9000感受態(tài)細(xì)胞的制備
                2.5.10 電轉(zhuǎn)化L.lactis NZ9000
                2.5.11 L.lactis NZ9000/pNZ8148-SPUsp45-MPpEGF陽(yáng)性克隆的篩選及鑒定
                2.5.12 L.lactis NZ9000/pNZ8148-MPUsp45-MPpEGF的誘導(dǎo)表達(dá)
                2.5.13 蛋白表達(dá)檢測(cè)
                2.5.14 pEGF的分泌活性鑒定
            2.6 數(shù)據(jù)分析
        3 試驗(yàn)結(jié)果與分析
            3.1 pNZ8148-Usp45-pEGF重組質(zhì)粒的構(gòu)建
                3.1.1 pNZ8148-Usp45-pEGF重組質(zhì)粒的構(gòu)建
                3.1.2 pMD19-SPUsp45-MPpEGF和pNZ8148雙酶切
            3.2 E.coli MC1061/pNZ8148-SPUsp45-MpEGF陽(yáng)性克隆鑒定
            3.3 L.lactis NZ9000/pNZ8148-SPUsp45-MpEGF重組菌的鑒定
            3.4 L.lactis NZ9000表達(dá)的pEGF蛋白檢測(cè)
            3.5 小鼠成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)特性
            3.6 rpEGF活性鑒定
                3.6.1 各處理組對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞CCL-1 L929增殖的影響
                3.6.2 BrdU標(biāo)記法檢測(cè)重組表達(dá)pEGF對(duì)CCL-1 L929細(xì)胞增殖的影響
        4 討論
        5 小結(jié)
    試驗(yàn)三：添加pEGF基因重組Lactococcus lactis對(duì)斷奶仔豬腸道健康的影響
        1 引言
        2 材料與方法
            2.1 試驗(yàn)動(dòng)物
            2.2 試驗(yàn)處理
            2.3 試驗(yàn)基礎(chǔ)飼糧
            2.4 圈舍和代謝籠的消毒
            2.5 飼養(yǎng)管理
            2.6 樣品的采集和處理
            2.7 測(cè)定指標(biāo)及方法
            2.8 數(shù)據(jù)分析
        3 試驗(yàn)結(jié)果與分析
            3.1 不同處理對(duì)仔豬生產(chǎn)性能的影響
            3.2 不同處理對(duì)仔豬腸黏膜形態(tài)的影響
            3.3 不同處理對(duì)仔豬腸道刷狀緣酶活的影響
            3.4 不同處理對(duì)仔豬腸道菌群的影響
        4 討論
        5 小結(jié)
第四部分 全文總結(jié)與研究展望
    1. 總體結(jié)論
    2. 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)
    3. 有待進(jìn)一步研究的問題
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文和科研參與情況


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]不同形式糖對(duì)榮昌仔豬小腸黏膜二糖酶活性和養(yǎng)分消化代謝的影響[J]. 蘭云賢,楊飛云,汪超,黃金秀,劉作華.  中國(guó)畜牧雜志. 2011(13)
[2]不同蛋白源日糧對(duì)斷奶仔豬小腸形態(tài)的影響[J]. 孫云子,余冰,陳代文.  中國(guó)飼料. 2011(12)
[3]乳酸菌基因組學(xué)研究現(xiàn)狀[J]. 顏翼,倫永志.  中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志(電子版). 2010(02)
[4]BrdU和EGFP標(biāo)記大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的對(duì)比研究[J]. 劉超,苗雷英,孫新華,孫宏晨,喬春燕.  口腔醫(yī)學(xué)研究. 2009(01)
[5]乳酸乳球菌NZ9000在小鼠體內(nèi)的定植研究[J]. 唐麗杰,徐毅剛,葛俊偉,任曉峰,汪淼,李一經(jīng).  中國(guó)乳品工業(yè). 2007(07)
[6]豬表皮生長(zhǎng)因子在大腸桿菌中的表達(dá)[J]. 楊桂香,黃偉華,彭險(xiǎn)峰.  華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2006(04)
[7]乳酸乳球菌NICE系統(tǒng)食品級(jí)載體pRNB48的構(gòu)建[J]. 徐波,曹郁生,陳燕,郭興華.  食品科技. 2006(10)
[8]人工合成苯丙氨酸脫氨酶基因在乳酸乳球菌中的食品級(jí)表達(dá)[J]. 賈興元,陳星,蘇暢,呂月平,高斌,肖白,劉敬忠.  中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志. 2006(01)
[9]表皮生長(zhǎng)因子對(duì)胃腸道的作用[J]. 黃晶晶,劉玉蘭.  飼料研究. 2005(12)
[10]構(gòu)建重組乳酸乳球菌生產(chǎn)谷胱甘肽[J]. 傅瑞燕,陳堅(jiān),李寅.  生物加工過程. 2004(02)



本文編號(hào)：3685813