參照Hlc基因序列設計干擾Hlc基因的干擾片段,構建表達載體,通過脂質體介導法,用構建的干擾質粒對水牛皮膚胎兒成纖維細胞的轉染體系進行了優(yōu)化,優(yōu)化出的條件為質粒濃度2μg/ml、脂質體濃度5μl/ml、復合物共孵化時間30min,優(yōu)化后的轉染效率為30.87%。接著,通過脂質體將3個干擾水牛Hlc基因質粒和1個陰性對照質粒轉入水牛胎兒皮膚成纖維細胞,并用qPCR檢測了其轉染24h和48h的水牛Hlc基因表達情況,以確定其干擾效果。結果表明,構建的3個干擾Hlc質粒都能在不同程度上下調水牛Hlc基因表達,而且在轉染48h比轉染24h下調水牛Hlc效果好。接著,為了研究下調Hlc表達后對水牛胎兒皮膚成纖維細胞生長的影響,將干擾質粒分別轉染水牛胎兒皮膚成纖維細胞,觀察轉染后24h和48h的細胞生長狀態(tài)。結果下調Hlc表達后,細胞生長受到抑制,甚至死亡,這表明水牛Hlc基因的表達對細胞生長分裂有著重要作用。隨后,為了篩選出穩(wěn)定轉染的細胞,對培養(yǎng)至7代的水牛胎兒皮膚成纖維細胞進行殺稻瘟菌素藥敏性檢測,得到10天內殺死全部細胞的最低濃度為2.6μg/ml。用三種構建的干擾質粒通過脂質體以優(yōu)化轉染條... 

【文章頁數】：60 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一部分 文獻綜述
    第一節(jié) RNAI研究進展
        1.1 RNAi的發(fā)現
        1.2 RNAi機制的研究
        1.3 RNAi特異性
        1.4 RNAi未來前景
    第二節(jié) H1基因研究進展
        2.1 H1組蛋白家族
        2.2 H1結構和功能
        2.3 H1基因表達模式
    第三節(jié) 脂質體轉染
        3.1 脂質體轉染作用機制
        3.2 影響脂質體轉染效率因素
    第四節(jié) 本研究的意義、目的與內容
        4.1 研究意義
        4.2 研究目的
        4.3 研究內容
第二部分 試驗部分
    前言
    一 試驗材料
        1 材料
        2 試劑配制
        3 主要儀器及設備
    二 試驗方法
        1 干擾序列的設計與合成
        2 干擾載體的構建與驗證
        3 質粒的擴增和提純
        4 細胞培養(yǎng)
        5 脂質體轉染細胞
        6 優(yōu)化脂質體轉染條件
        7 流式細胞儀檢測
        8 RNA抽提
        9 反轉錄
        10 QPCR擴增
        11 細胞殺稻瘟菌素藥敏性檢測
        12 純化轉染細胞
        13 數據分析
    三 結果與分析
        1 質粒及對應的測序結果
        2 轉染條件優(yōu)化
        3 轉染干擾質粒后對細胞Hlc的表達量的影響
        4 干擾Hlc基因表達對細胞的影響
        5 純化轉染細胞
    四 討論
        1 干涉水牛胎兒皮膚成纖維細胞Hlc基因的表達
        2 優(yōu)化脂質體轉染條件
        3 干涉水牛胎兒皮膚成纖維細胞Hlc基因表達對細胞的影響
    五 小結
參考文獻
附章
致謝
攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文


【參考文獻】：
期刊論文
[1]陽離子脂質體用做基因傳遞載體的研究進展[J]. 楊碩曄,陳西敬.  中國新藥雜志. 2010(20)



本文編號：3683288