參照Hlc基因序列設(shè)計(jì)干擾Hlc基因的干擾片段,構(gòu)建表達(dá)載體,通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)法,用構(gòu)建的干擾質(zhì)粒對(duì)水牛皮膚胎兒成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染體系進(jìn)行了優(yōu)化,優(yōu)化出的條件為質(zhì)粒濃度2μg/ml、脂質(zhì)體濃度5μl/ml、復(fù)合物共孵化時(shí)間30min,優(yōu)化后的轉(zhuǎn)染效率為30.87%。接著,通過(guò)脂質(zhì)體將3個(gè)干擾水牛Hlc基因質(zhì)粒和1個(gè)陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)入水牛胎兒皮膚成纖維細(xì)胞,并用qPCR檢測(cè)了其轉(zhuǎn)染24h和48h的水牛Hlc基因表達(dá)情況,以確定其干擾效果。結(jié)果表明,構(gòu)建的3個(gè)干擾Hlc質(zhì)粒都能在不同程度上下調(diào)水牛Hlc基因表達(dá),而且在轉(zhuǎn)染48h比轉(zhuǎn)染24h下調(diào)水牛Hlc效果好。接著,為了研究下調(diào)Hlc表達(dá)后對(duì)水牛胎兒皮膚成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,將干擾質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染水牛胎兒皮膚成纖維細(xì)胞,觀察轉(zhuǎn)染后24h和48h的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。結(jié)果下調(diào)Hlc表達(dá)后,細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制,甚至死亡,這表明水牛Hlc基因的表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)分裂有著重要作用。隨后,為了篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,對(duì)培養(yǎng)至7代的水牛胎兒皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行殺稻瘟菌素藥敏性檢測(cè),得到10天內(nèi)殺死全部細(xì)胞的最低濃度為2.6μg/ml。用三種構(gòu)建的干擾質(zhì)粒通過(guò)脂質(zhì)體以優(yōu)化轉(zhuǎn)染條... 

【文章頁(yè)數(shù)】：60 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一部分 文獻(xiàn)綜述
    第一節(jié) RNAI研究進(jìn)展
        1.1 RNAi的發(fā)現(xiàn)
        1.2 RNAi機(jī)制的研究
        1.3 RNAi特異性
        1.4 RNAi未來(lái)前景
    第二節(jié) H1基因研究進(jìn)展
        2.1 H1組蛋白家族
        2.2 H1結(jié)構(gòu)和功能
        2.3 H1基因表達(dá)模式
    第三節(jié) 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染
        3.1 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染作用機(jī)制
        3.2 影響脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率因素
    第四節(jié) 本研究的意義、目的與內(nèi)容
        4.1 研究意義
        4.2 研究目的
        4.3 研究?jī)?nèi)容
第二部分 試驗(yàn)部分
    前言
    一 試驗(yàn)材料
        1 材料
        2 試劑配制
        3 主要儀器及設(shè)備
    二 試驗(yàn)方法
        1 干擾序列的設(shè)計(jì)與合成
        2 干擾載體的構(gòu)建與驗(yàn)證
        3 質(zhì)粒的擴(kuò)增和提純
        4 細(xì)胞培養(yǎng)
        5 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞
        6 優(yōu)化脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染條件
        7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)
        8 RNA抽提
        9 反轉(zhuǎn)錄
        10 QPCR擴(kuò)增
        11 細(xì)胞殺稻瘟菌素藥敏性檢測(cè)
        12 純化轉(zhuǎn)染細(xì)胞
        13 數(shù)據(jù)分析
    三 結(jié)果與分析
        1 質(zhì)粒及對(duì)應(yīng)的測(cè)序結(jié)果
        2 轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化
        3 轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒后對(duì)細(xì)胞Hlc的表達(dá)量的影響
        4 干擾Hlc基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞的影響
        5 純化轉(zhuǎn)染細(xì)胞
    四 討論
        1 干涉水牛胎兒皮膚成纖維細(xì)胞Hlc基因的表達(dá)
        2 優(yōu)化脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染條件
        3 干涉水牛胎兒皮膚成纖維細(xì)胞Hlc基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞的影響
    五 小結(jié)
參考文獻(xiàn)
附章
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]陽(yáng)離子脂質(zhì)體用做基因傳遞載體的研究進(jìn)展[J]. 楊碩曄,陳西敬.  中國(guó)新藥雜志. 2010(20)



本文編號(hào)：3683288