豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的以腹瀉、嘔吐、脫水為主要特征的一種腸道接觸性傳染病,該病對哺乳仔豬的致死率高達90%。近年來,PEDV在世界范圍內(nèi)再次暴發(fā),呈現(xiàn)明顯的抬頭趨勢。磷酸化作用是瞬時蛋白質(zhì)修飾最普遍形式,病毒利用宿主激酶系統(tǒng)對病毒蛋白質(zhì)進行磷酸化修飾從而獲得高效的感染及控制宿主先天免疫。然而,目前關(guān)于PEDV感染介導宿主細胞磷酸化蛋白變化的報道較少。本研究中,利用等重同位素多標簽相對定量磷酸化蛋白質(zhì)組學技術(shù)對PEDV感染的Vero E6細胞（V組,3個生物學重復(fù)）和PEDV未感染的Vero E6細胞（C組,3個生物學重復(fù)）差異表達的磷酸化蛋白進行篩選和功能解析。結(jié)果顯示,在V組和C組中,鑒定磷酸化肽段總數(shù)2 385個,鑒定磷酸化蛋白數(shù)為1134個（已知磷酸化蛋白455個,未知磷酸化蛋白679個）。在V組和C組中一共存在109個差異表達磷酸化蛋白（p＜0.05,V/C或C/V＞1.5）,其中,差異表達磷酸化蛋白中上調(diào)的磷酸化蛋白數(shù)為72... 

【文章頁數(shù)】：107 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
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英文摘要
1 文獻綜述
    1.1 豬流行性腹瀉概述
        1.1.1 PED的流行
        1.1.2 PED的診斷
        1.1.3 PED的預(yù)防
        1.1.4 PED的治療
    1.2 豬流行性腹瀉病毒概述
        1.2.1 PEDV病毒學分類地位
        1.2.2 PEDV基因組結(jié)構(gòu)
        1.2.3 PEDV編碼的蛋白及功能
        1.2.4 PEDV的感染發(fā)生機制
    1.3 蛋白質(zhì)組學技術(shù)
        1.3.1 蛋白質(zhì)組學
        1.3.2 蛋白質(zhì)組學在病毒學中的應(yīng)用
        1.3.3 同位素標記相對與絕對定量(iTRAQ)技術(shù)
    1.4 磷酸化蛋白質(zhì)組學技術(shù)
        1.4.1 蛋白質(zhì)磷酸化的概況
        1.4.2 磷酸化蛋白樣品的分離富集
        1.4.3 磷酸化蛋白位點鑒定與分析
        1.4.4 磷酸化蛋白質(zhì)組學在病毒感染中的應(yīng)用
    1.5 豬流行性腹瀉感染相關(guān)蛋白研究進展
    1.6 本研究的目的意義
2 VeroE6細胞感染PEDV樣品制備
    2.1 試驗材料
        2.1.1 病毒與細胞
        2.1.2 主要生化試劑
        2.1.3 主要儀器設(shè)備
    2.2 試驗方法
        2.2.1 VeroE6細胞的培養(yǎng)
        2.2.2 Vero E6細胞樣品制備
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 PEDV感染VeroE6細胞樣品的制備
        2.3.2 蛋白質(zhì)濃度測定結(jié)果
        2.3.3 Westernblot鑒定PEDV感染VeroE6細胞
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
3 基于iTRAQ技術(shù)的VeroE6細胞差異表達磷酸化蛋白質(zhì)組學研究
    3.1 試驗材料
        3.1.1 主要生化試劑
        3.1.2 主要儀器設(shè)備
    3.2 試驗方法
        3.2.1 酶解和肽段定量
        3.2.2 肽段標記
        3.2.3 二氧化鈦富集
        3.2.4 質(zhì)譜分析
        3.2.5 蛋白質(zhì)鑒定與分析
        3.2.6 驗證差異表達蛋白
        3.2.7 驗證樣品中Hsp70的表達
        3.2.8 細胞樣品的制備、RNA的提取及實時熒光定量RT-PCR
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 酶解肽段濃度測定
        3.3.2 磷酸化蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果統(tǒng)計
        3.3.3 定量比值頻數(shù)分布直方圖
        3.3.4 差異表達磷酸化蛋白結(jié)果
        3.3.5 差異表達磷酸化蛋白質(zhì)分子量分布
        3.3.6 差異表達磷酸化蛋白質(zhì)等電點分布
        3.3.7 生物信息學(GO分析)
        3.3.8 差異表達磷酸化蛋白的KEGG通路和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)
        3.3.9 差異表達蛋白驗證
        3.3.10 Westernblot驗證溫度對Hsp70的影響
        3.3.11 熒光定量PCR鑒定PEDV的相對表達量
    3.4 討論
        3.4.1 病毒感染相關(guān)信號通路
        3.4.2 差異磷酸化蛋白與病毒感染
    3.5 小結(jié)
4 結(jié)論
參考文獻
致謝
附錄
個人簡歷


【參考文獻】：
期刊論文
[1]天冬氨酸作為非特異性吸附抑制劑在二氧化鈦選擇性富集磷酸肽中的應(yīng)用[J]. 遲明,畢煒,盧莊,宋麗娜,賈偉,張養(yǎng)軍,錢小紅,蔡耘.  色譜. 2010(02)
[2]豬流行性腹瀉病毒功能性受體的鑒定[J]. 李寶賢,馬廣鵬,葛俊偉,李一經(jīng).  病毒學報. 2009(03)
[3]豬流行性腹瀉病毒S蛋白受體結(jié)合域的分析[J]. 孫東波,陳建飛,時洪艷,申識川,呂茂杰,范秀萍,陳洪巖,馮力.  畜牧獸醫(yī)學報. 2009(04)
[4]流行性腹瀉病毒M基因與甲病毒載體重組RNA的構(gòu)建[J]. 余麗蕓,侯喜林.  動物醫(yī)學進展. 2005(05)
[5]核不均一核糖核蛋白與病毒復(fù)制[J]. 馮曉輝,湯承,朱鑫,岳華.  畜牧獸醫(yī)學報. 2015(06)
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博士論文
[1]永生化豬小腸上皮細胞系的建立及豬輪狀病毒對其影響的研究[D]. 王靜.西北農(nóng)林科技大學 2014
[2]豬流行性腹瀉病毒AJ1102株的分離、鑒定及其分子進化特征[D]. 畢靜.華中農(nóng)業(yè)大學 2013

碩士論文
[1]上海地區(qū)PCV2分子流行病學及PCV2感染豬肺泡巨噬細胞的磷酸化蛋白組學研究[D]. 石坤.中國農(nóng)業(yè)科學院 2016
[2]豬流行性腹瀉病毒對細胞微絲骨架及緊密連接的影響[D]. 高君愷.南京農(nóng)業(yè)大學 2013
[3]豬圓環(huán)病毒2型感染豬肺泡巨噬細胞的蛋白質(zhì)組學研究[D]. 張敏.華中農(nóng)業(yè)大學 2010



本文編號：3680540