新城疫（Newcastle disease,ND）是一種由副粘病毒科新城疫病毒（Newcastle diseas virus,NDV）引起的禽類致死性傳染病,該病具有發(fā)病急、死亡率高等特點(diǎn),嚴(yán)重危害了我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)。F蛋白是NDV的主要保護(hù)性抗原之一,可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體,并在機(jī)體免疫中發(fā)揮重要作用;而HN蛋白是NDV的另一保護(hù)性抗原,同樣可以對(duì)機(jī)體起到一定的保護(hù)作用。然而在不同表達(dá)系統(tǒng)中,F與HN蛋白對(duì)機(jī)體的免疫保護(hù)率卻不盡相同。因此,選擇合適的抗原基因來(lái)對(duì)機(jī)體進(jìn)行免疫顯得至關(guān)重要。本研究以新城疫病毒Lasota株的F及HN為目的基因,將二者分別插入帶有CMV啟動(dòng)子及VSV-GED、WPRE、ITRs等不同調(diào)控元件的假型化桿狀病毒與未經(jīng)改造的桿狀病毒基因轉(zhuǎn)移載體中,通過(guò)Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)獲得重組Bacmid DNA,將其轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞,獲得重組桿狀病毒;利用高滴度重組桿狀病毒侵染雞胚成纖維細(xì)胞,通過(guò)SDS-PAGE和Western blotting比較不同抗原基因在禽類細(xì)胞中的表達(dá)水平;同時(shí)利用獲得的重組桿狀病毒直接作為疫苗進(jìn)行免疫,比較分析帶有不同調(diào)控元件及不同抗原... 

【文章頁(yè)數(shù)】：116 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
符號(hào)與縮略語(yǔ)
第1章 緒論
    1.1 新城疫病毒的研究進(jìn)展
        1.1.1 ND的流行
        1.1.2 NDV的生物學(xué)性狀
        1.1.3 NDV基因組結(jié)構(gòu)特征
        1.1.4 NDV基因編碼的主要蛋白及其功能
        1.1.5 ND的防制
    1.2 新城疫基因工程疫苗研究進(jìn)展
        1.2.1 核酸疫苗
        1.2.2 亞單位疫苗
        1.2.3 活載體疫苗
        1.2.4 以NDV為活載體構(gòu)建多價(jià)疫苗
    1.3 桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)概述
        1.3.1 桿狀病毒的生物學(xué)特征
        1.3.2 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)及其優(yōu)缺點(diǎn)
    1.4 桿狀病毒作為疫苗載體的應(yīng)用
        1.4.1 桿狀病毒作為哺乳動(dòng)物疫苗載體的應(yīng)用
        1.4.2 桿狀病毒作為禽類疫苗載體的應(yīng)用
        1.4.3 桿狀病毒雙表達(dá)系統(tǒng)在疫苗載體中的應(yīng)用
    1.5 本研究的目的和意義
    1.6 本研究的實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線
        1.6.1 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建策略
        1.6.2 重組桿狀病毒的擴(kuò)增和外源基因的表達(dá)
        1.6.3 重組桿狀病毒免疫效果的研究
    1.7 課題資助名稱
第2章 材料與方法
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 供試材料
        2.1.2 供試菌種和質(zhì)粒
        2.1.3 擴(kuò)增引物
        2.1.4 主要儀器設(shè)備
        2.1.5 主要分子生物學(xué)及生化試劑
        2.1.6 主要緩沖液及試劑配制
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
        2.2.2 重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid DNA的獲得
        2.2.3 重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid DNA轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞
        2.2.4 重組桿狀病毒的擴(kuò)增及滴度測(cè)定
        2.2.5 重組桿狀病毒在雞胚成纖維細(xì)胞中表達(dá)
        2.2.6 重組蛋白的SDS-PAGE及其Western-blotting檢測(cè)
        2.2.7 VSV-GED蛋白的間接免疫熒光檢測(cè)
        2.2.8 重組桿狀病毒的雞體免疫試驗(yàn)
第3章 結(jié)果
    3.1 重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
        3.1.1 重組轉(zhuǎn)移載體pLM-F系列的構(gòu)建
        3.1.2 重組轉(zhuǎn)移載體pLM-HN系列的構(gòu)建
    3.2 重組桿狀病毒穿梭載體的鑒定
        3.2.1 重組穿梭轉(zhuǎn)移載體Bacmid F系列的鑒定
        3.2.2 重組穿梭轉(zhuǎn)移載體Bacmid HN系列的鑒定
    3.3 重組桿狀病毒穿梭載體轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞
        3.3.1 Sf9昆蟲細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制
        3.3.2 Sf9昆蟲細(xì)胞正常及病變形態(tài)比較
    3.4 重組桿狀病毒的擴(kuò)增及滴度測(cè)定
        3.4.1 重組桿狀病毒滴度測(cè)定
        3.4.2 重組桿狀病毒的PCR鑒定
    3.5 重組桿狀病毒介導(dǎo)目的基因在雞胚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及分析
        3.5.1 雞胚成纖維細(xì)胞的形態(tài)
        3.5.2 重組蛋白的SDS-PAGE及其Western-blotting鑒定
        3.5.3 重組蛋白的Western blotting分析
    3.6 VSV-GED蛋白的間接免疫熒光檢測(cè)
    3.7 動(dòng)物免疫—攻毒試驗(yàn)
        3.7.1 免疫和攻毒后各試驗(yàn)組的臨床癥狀及免疫保護(hù)率
        3.7.2 病理學(xué)觀察
        3.7.3 F48E9強(qiáng)毒株TCID_(50)的測(cè)定
        3.7.4 免疫雞血清中和抗體效價(jià)的測(cè)定
        3.7.5 免疫雞血清IgG抗體檢測(cè)
        3.7.6 免疫雞淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)
        3.7.7 免疫雞血清細(xì)胞因子檢測(cè)
第4章 討論
    4.1 課題背景
    4.2 編碼的抗原基因?qū)χ亟M桿狀病毒疫苗免疫原性的影響
    4.3 載體對(duì)重組桿狀病毒疫苗免疫原性的影響
        4.3.1 WPRE和VSV-GED元件對(duì)外源基因表達(dá)效率的影響
        4.3.2 ITRs對(duì)外源基因表達(dá)的影響
    4.4 免疫劑量和免疫程序的選擇
第5章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況



本文編號(hào)：3679333