星狀病毒（Astrovirus,AstV）是單股正義的RNA病毒,主要感染哺乳類和禽類動物,同時也是一種人畜共患病病毒。豬星狀病毒在豬群中感染率較高,在世界各地均有分布。星狀病毒變異較快,且諸多證據(jù)表明毒株之間可以發(fā)生重組。系統(tǒng)發(fā)育分析和蛋白解析發(fā)現(xiàn),星狀病毒是一種快速進化的病毒,它通過復(fù)制選擇重組交換其衣殼的部分結(jié)構(gòu)域,產(chǎn)生細胞嗜性的擴展。顯然該病毒具有跨種間傳播及適應(yīng)新宿主的能力,與此同時星狀病毒也有許多新型的臨床癥狀,如腦炎、痛風等相關(guān)。本研究利用生物信息學的方法,對星狀病毒中兩個未知蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進行預(yù)測,并基于豬星狀病毒反向遺傳操作系統(tǒng),探究兩個蛋白對病毒生物學特性的影響。1.豬星狀病毒ORFX和ORFY蛋白的結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測及多克隆抗體的制備本研究通過生物信息學的方法對星狀病毒的基因組進行分析,發(fā)現(xiàn)兩個潛在的開放閱讀框ORFX和ORFY,并對ORFX和ORFY編碼的蛋白進行結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測。ORFX與ORF2的5’端重疊,與ORF2的起始密碼子間隔7個氨基酸;ORFY位于ORF2編碼的保守區(qū)P1結(jié)構(gòu)域,與ORF2的起始密碼子間隔約299個氨基酸。利用蛋白質(zhì)庫和相關(guān)服務(wù)器對蛋... 

【文章頁數(shù)】：89 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
英文縮寫對照表
第一章 文獻綜述
    1.1 星狀病毒的發(fā)現(xiàn)
    1.2 星狀病毒的分類
    1.3 星狀病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)
    1.4 星狀病毒的基因組結(jié)構(gòu)
    1.5 星狀病毒的蛋白特征
    1.6 星狀病毒的流行病學
        1.6.1 人星狀病毒
        1.6.2 豬星狀病毒
        1.6.3 犬星狀病毒
        1.6.4 鴨星狀病毒
    1.7 星狀病毒的發(fā)病機制
    1.8 星狀病毒的臨床癥狀
    1.9 星狀病毒的檢測方法
        1.9.1 電子顯微鏡
        1.9.2 病毒的分離與鑒定
        1.9.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)
        1.9.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)
        1.9.5 定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-qPCR)
        1.9.6 高通量測序(High-throughputsequencing,HTS)
    1.10 研究的目的與意義
第二章 豬星狀病毒ORFX和ORFY蛋白結(jié)構(gòu)與功能的預(yù)測及多克隆抗體的制備
    2.1 結(jié)果與分析
        2.1.1 ORFX和ORFY蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)分析
        2.1.2 ORFX和ORFY蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析
        2.1.3 ORFX和ORFY蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測
    2.2 討論與小結(jié)
第三章 ORFX和ORFY蛋白的原核表達及多克隆抗體的制備
    3.1 材料與方法
        3.1.1 質(zhì)粒和菌株
        3.1.2 材料和試劑
        3.1.3 實驗動物
        3.1.4 主要儀器設(shè)備
        3.1.5 主要試劑配方
    3.2 方法
        3.2.1 引物設(shè)計
        3.2.2 基因擴增
        3.2.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測
        3.2.4 反應(yīng)液回收
        3.2.5 原核表達載體的酶切與鑒定
        3.2.6 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
        3.2.7 陽性克隆小量表達與鑒定
        3.2.8 重組蛋白的大量表達
        3.2.9 包涵體蛋白的洗滌與純化
        3.2.10 純化蛋白的濃度測定
        3.2.11 多克隆抗體的制備
        3.2.12 IFA鑒定多克隆抗體的反應(yīng)性
        3.2.13 Western blotting檢測多克隆抗體與蛋白的特異性
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 基因擴增結(jié)果
        3.3.2 重組質(zhì)粒的鑒定
        3.3.3 小量表達鑒定
        3.3.4 IFA鑒定多克隆抗體反應(yīng)性的結(jié)果
        3.3.5 WB鑒定多克隆抗體與重組蛋白的特異性
    3.4 討論與分析
第四章 pT7-ORFX和pT7-ORFY突變株的構(gòu)建和拯救
    4.1 實驗材料
        4.1.1 病毒與細胞
        4.1.2 材料與試劑
    4.2 實驗方法
        4.2.1 引物設(shè)計
        4.2.2 基因片段克隆
        4.2.3 突變株拯救
        4.2.4 拯救毒株的鑒定
    4.4 實驗結(jié)果
        4.4.1 基因定點突變克隆和測序結(jié)果
        4.4.2 細胞病變觀察
        4.4.3 突變毒株的突變位點檢測
        4.4.4 拯救病毒的生長特性
        4.4.5 間接免疫熒光鑒定結(jié)果
    4.5 討論與分析
第五章 全文結(jié)論
參考文獻
致謝
攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文
附件


【參考文獻】：
期刊論文
[1]廣西豬星狀病毒分子流行病學調(diào)查[J]. 蘭家暖,劉磊,郭旋,張民秀,盧冰霞,黃福標,覃熊慧,張寧,黃偉堅.  中國預(yù)防獸醫(yī)學報. 2012(08)
[2]163例住院腹瀉患兒糞便標本星狀病毒檢測[J]. 劉亞誼,喬海平,徐云鶴.  中國兒童保健雜志. 1999(03)

博士論文
[1]鴨星狀病毒的遺傳變異性和抗原性及感染鴨肝臟的轉(zhuǎn)錄組分析[D]. 劉寧.中國農(nóng)業(yè)大學 2017

碩士論文
[1]2型豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白的表達生產(chǎn)[D]. 陳小紅.華東理工大學 2016



本文編號：3675685