建立一種檢測牛IFN-α、IFN-β基因SYBY GreenⅠ實時熒光定量PCR方法,旨在為抗病毒相關(guān)研究奠定基礎。設計合成擴增牛IFN-α、IFN-β基因的特異性引物,采用RT-PCR從牛脾臟中擴增出目的DNA片段,將其克隆至pMD18-T載體獲得牛IFN-α、IFN-β質(zhì)粒標準品,以質(zhì)粒標準品為模板,優(yōu)化熒光定量PCR反應條件,建立牛IFN-α、IFN-β基因SYBY GreenⅠ實時熒光定量PCR方法,結(jié)果表明,牛IFN-α、IFN-β標準曲線的R2分別為0.958 8和0.996 52,線性良好;擴增效率為0.97和0.91,效率高;熔解曲線均為單峰,特異性較高,并具有良好的重復。結(jié)果證實,本研究所建立的方法敏感性高,特異性強,重復性好。 

【文章頁數(shù)】：5 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 實驗材料
    1.2 主要試劑與儀器
    1.3 引物設計與合成
    1.4 質(zhì)粒標準品的構(gòu)建
        1.4.1 牛脾臟組織總RNA的提取
        1.4.2 反轉(zhuǎn)錄
        1.4.3 PCR反應
        1.4.4 核酸凝膠電泳試驗
        1.4.5 基因克隆與序列分析
    1.5 標準曲線的構(gòu)建
        1.5.1 測定質(zhì)粒標準品的濃度
        1.5.2 熒光定量PCR標準曲線的建立
    1.6 熒光定量PCR的重復性試驗
    1.7 熒光定量PCR的特異性試驗
    1.8 熒光定量PCR的敏感性試驗
2 結(jié)果
    2.1 核酸瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果
    2.2 序列分析結(jié)果
    2.3 質(zhì)粒標準品的制備
    2.4 熒光定量PCR標準曲線的建立結(jié)果
    2.5 熒光定量PCR的重復性試驗結(jié)果
    2.6 熒光定量PCR的特異性試驗結(jié)果
    2.7 熒光定量PCR的敏感性試驗結(jié)果
3 討論
4 結(jié)論


【參考文獻】：
期刊論文
[1]水貂IFN-α、IFN-β及IFN-γmRNA熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及應用[J]. 王洋,胡博,張海玲,魯榮光,呂爽,劉昊,孫彥剛,馬凡舒,趙建軍,張蕾,薛向紅,史寧,白雪,徐淑娟,范思寧,凌明玉,李欣彤,閆喜軍.  動物醫(yī)學進展. 2015(11)
[2]比格犬IFN-α和IFN-β mRNA SYBR GreenⅠ熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[J]. 潘福星,王冬冬,曹志偉,馮培祥,劉宏,齊娟,孫忠晟,王祖榮,尹燕博.  中國預防獸醫(yī)學報. 2014(04)
[3]雞IL-6、IL-17和IFN-γ實時熒光定量PCR檢測方法的建立[J]. 張昆麗,謝芝勛,滕麗瓊,謝麗基,劉加波,范晴,龐耀珊,羅思思,謝志勤,鄧顯文.  南方農(nóng)業(yè)學報. 2013(10)
[4]豬IFN-β和IRF-3基因?qū)崟r熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[J]. 王蕊,張改平,喬松林,劉永暉,蔣志政,萬博,鮑登克,王愛萍.  河南農(nóng)業(yè)科學. 2012(05)
[5]豬IL-4、IL-6和IL-10 SYBR Green Ⅰ real-time PCR檢測方法的建立及應用[J]. 施開創(chuàng),李煥榮,楊漢春,郭鑫,蓋新娜.  中國預防獸醫(yī)學報. 2010(02)
[6]基于M基因的新城疫病毒實時熒光定量RT-PCR的建立及其對臨床樣品中新城疫病毒檢測的研究[J]. 曹軍平,胡順林,吳雙,劉慧謀,劉曉文,王曉泉,吳艷濤,劉秀梵.  畜牧獸醫(yī)學報. 2009(07)
[7]熒光定量RT-PCR檢測雞α干擾素mRNA方法的建立[J]. 雷小文,岳華,李明義,湯承.  河南農(nóng)業(yè)大學學報. 2009(03)
[8]雞IFN-α和IFN-β及IFN-γ基因?qū)崟r熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[J]. 張賀楠,賴漢漳,齊巖,孔留五,張小桃,曹偉勝,廖明.  中國獸醫(yī)科學. 2009(02)
[9]豬IFN-γ mRNA Taq Man熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[J]. 韋天超,田志軍,周艷君,安同慶,肖燕,彭金美,姜一峰,童光志.  中國獸醫(yī)科學. 2009(02)
[10]雞γ-干擾素實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[J]. 王群,劉光亮,童鐵鋼,肖一紅,吳東來.  中國獸醫(yī)科學. 2007(07)

博士論文
[1]牛Ⅰ型干擾素家族新成員（IFN-ε、IFN-κ、IFN-χ）抗病毒信號轉(zhuǎn)導與表達調(diào)控研究[D]. 郭永麗.東北農(nóng)業(yè)大學 2017

碩士論文
[1]綿羊白介素1β及其受體拮抗因子熒光定量PCR檢測方法的建立與應用[D]. 遲丹.吉林大學 2016



本文編號：3667989