日本乙型腦炎（Japanese encephalitis,JE）是由日本乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）引起的一種嚴(yán)重影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的蟲(chóng)媒性人獸共患傳染病。Pr M蛋白是JEV的結(jié)構(gòu)蛋白之一,主要存在于感染細(xì)胞內(nèi)未成熟的病毒顆粒中。M蛋白由Pr M蛋白切割而來(lái),參與病毒囊膜的構(gòu)成,與E蛋白的C端相互作用,在細(xì)胞內(nèi)對(duì)E蛋白進(jìn)行折疊、修飾和裝配,可誘生輕度中和抗體,與病毒核心組成具有感染性的病毒。同時(shí)JEV靶向神經(jīng)元,可激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞信號(hào),誘發(fā)大量細(xì)胞因子和促炎癥因子的分泌,引起大腦炎癥風(fēng)暴。但是,Pr M在病毒復(fù)制、感染以及誘導(dǎo)中和抗體活性中的功能還不清楚,同時(shí)在細(xì)胞內(nèi)如何對(duì)E蛋白進(jìn)行折疊、修飾和裝配也不清楚。另外JEV在引起大腦炎癥風(fēng)暴的過(guò)程中,還有哪些潛在的蛋白會(huì)產(chǎn)生作用,也沒(méi)有得到完整的解答。本研究制備了Pr M/M的單克隆抗體,并通過(guò)間接ELISA、IFA、Western Blot等方法驗(yàn)證單抗的生物學(xué)特性。同時(shí),利用i TRAQ技術(shù)對(duì)JEV P3感染U251細(xì)胞的蛋白質(zhì)組進(jìn)行了分析。具體研究?jī)?nèi)容如... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
中英文縮略語(yǔ)表（Abbreviation）
第一章JEV文獻(xiàn)綜述
    1. 乙型腦炎的流行病學(xué)
        1.1 乙腦的流行特征
        1.2 乙腦的傳播媒介與易感群體
    2. 乙型腦炎病毒的生物學(xué)特性
        2.1 乙型腦炎病毒的病原性
        2.2 乙型腦炎病毒的生物學(xué)特性
        2.3 乙型腦炎病毒的結(jié)構(gòu)蛋白
        2.4 乙型腦炎病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白
        2.5 乙型腦炎病毒的理化特性
        2.6 乙型腦炎病毒的增殖特性
        2.7 乙型腦炎病毒的復(fù)制過(guò)程
    3. 乙型腦炎病毒的入侵和致病機(jī)理
    4. 乙型腦炎的臨床表現(xiàn)
    5. 乙型腦炎的病理變化
    6. 乙型腦炎的診斷
        6.1 血清學(xué)檢測(cè)
        6.2 病毒分離培養(yǎng)
        6.3 分子生物學(xué)檢測(cè)
    7. 乙型腦炎的防治及疫苗研究現(xiàn)狀
        7.1 滅活疫苗
        7.2 減毒活疫苗
第二章JEV M蛋白單克隆抗體的制備及特性分析
    1.前言
        1.1 單克隆抗體的原理
        1.2 單克隆抗體的應(yīng)用及發(fā)展
    2.研究目的與意義
    3. 材料與方法
        3.1 實(shí)驗(yàn)材料
            3.1.1 質(zhì)粒、菌株、病毒、細(xì)胞和動(dòng)物
            3.1.2 主要試劑、儀器和耗材
            3.1.3 抗生素及其配制方法
            3.1.4 主要培養(yǎng)基及其配制
            3.1.5 主要緩沖液（溶液）及其配制
        3.2 實(shí)驗(yàn)方法與步驟
            3.2.1 M蛋白引物的設(shè)計(jì)
            3.2.2 M蛋白基因的擴(kuò)增
            3.2.3 M蛋白基因片段的純化回收
            3.2.4 PCR回收產(chǎn)物及表達(dá)載體的處理
            3.2.5 目的基因與載體的連接
            3.2.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            3.2.7 重組質(zhì)粒的提取
            3.2.8 重組質(zhì)粒的鑒定
            3.2.9 重組質(zhì)粒p28a-sumo-M的誘導(dǎo)表達(dá)
            3.2.10 表達(dá)產(chǎn)物p28a-sumo-M的SDS-PAGE分析
            3.2.11 表達(dá)產(chǎn)物p28a-sumo-M的Western Blot分析
            3.2.12 不溶性包涵體蛋白純化方法
            3.2.13 動(dòng)物免疫
            3.2.14 間接ELISA檢測(cè)方法的建立
            3.2.15 間接ELISA法檢測(cè)小鼠的免疫效價(jià)
            3.2.16 SP2/0 骨髓瘤細(xì)胞的制備
            3.2.17 免疫脾細(xì)胞的制備
            3.2.18 飼養(yǎng)細(xì)胞的制備
            3.2.19 細(xì)胞融合
            3.2.20 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選
            3.2.21 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的亞克隆
            3.2.22 雜交瘤細(xì)胞的染色體計(jì)數(shù)
            3.2.23 單抗腹水的制備及抗體效價(jià)的測(cè)定
            3.2.24 單克隆抗體的純化
            3.2.25 單克隆抗體蛋白質(zhì)含量的測(cè)定
            3.2.26 單克隆抗體的亞型鑒定
            3.2.27 單克隆抗體的IFA分析
            3.2.28 單克隆抗體的Western Blot分析
            3.2.29 單克隆抗體靶抗原表位區(qū)域的分析
            3.2.30 小片段的原核表達(dá)
            3.2.31 單克隆抗體靶抗原表位的粗步判定
    4.結(jié)果與分析
        4.1 結(jié)果
            4.1.1 M基因片段PCR擴(kuò)增及克隆質(zhì)粒的鑒定
            4.1.2 p28a-sumo-M重組蛋白的表達(dá)及純化
            4.1.3 M蛋白最佳抗原包被濃度的測(cè)定
            4.1.4 小鼠免疫效價(jià)的檢測(cè)
            4.1.5 雜交瘤細(xì)胞的篩選
            4.1.6 雜交瘤細(xì)胞遺傳性的穩(wěn)定分析
            4.1.7 單克隆抗體效價(jià)的檢測(cè)
            4.1.8 單克隆抗體亞型的檢測(cè)
            4.1.9 單克隆抗體的IFA分析
            4.1.10 單克隆抗體的Western Blot分析
            4.1.11 單克隆抗體靶抗原表位區(qū)域的分析
            4.1.12 小片段的原核表達(dá)分析
            4.1.13 M蛋白抗原表位的區(qū)域分析
    5. 討論與結(jié)論
        5.1 討論
            5.1.1 單抗的應(yīng)用前景
            5.1.2 蛋白表達(dá)
            5.1.3 動(dòng)物免疫
            5.1.4 細(xì)胞融合
            5.1.5 單克隆抗體的篩選
            5.1.6 M蛋白靶抗原的鑒定
        5.2 小結(jié)
第三章 基于iTRAQ技術(shù)研究JEV P3 株感染U251 細(xì)胞的蛋白表達(dá)差異
    1. 前言
    2. 研究目的與意義
    3. 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2 實(shí)驗(yàn)方法
            3.2.1 U251 細(xì)胞的復(fù)蘇
            3.2.2 病毒感染
            3.2.3 iTRAQ技術(shù)分析細(xì)胞樣品
            3.2.4 熒光定量引物的設(shè)計(jì)
            3.2.5 病毒總RNA的提取
            3.2.6 RT-PCR
            3.2.7 轉(zhuǎn)錄水平蛋白表達(dá)差異分析
            3.2.8 基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析
    4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        4.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            4.1.1 蛋白質(zhì)的鑒定
            4.1.2 GO分析
            4.1.3 差異蛋白定量信息的統(tǒng)計(jì)
            4.1.4 熒光定量分析差異蛋白質(zhì)的mRNA水平
    5. 討論與結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
[1]日本乙型腦炎病毒prM-E蛋白N-糖基化的功能研究[D]. 宰俊杰.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
[2]流行性乙型腦炎病毒E蛋白基因主要抗原域的原核表達(dá)及ELISA診斷試劑盒的研制[D]. 楊耀武.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 2003



本文編號(hào)：3665086