日本乙型腦炎（Japanese encephalitis,JE）是由日本乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）引起的一種嚴重影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的蟲媒性人獸共患傳染病。Pr M蛋白是JEV的結(jié)構(gòu)蛋白之一,主要存在于感染細胞內(nèi)未成熟的病毒顆粒中。M蛋白由Pr M蛋白切割而來,參與病毒囊膜的構(gòu)成,與E蛋白的C端相互作用,在細胞內(nèi)對E蛋白進行折疊、修飾和裝配,可誘生輕度中和抗體,與病毒核心組成具有感染性的病毒。同時JEV靶向神經(jīng)元,可激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞信號,誘發(fā)大量細胞因子和促炎癥因子的分泌,引起大腦炎癥風(fēng)暴。但是,Pr M在病毒復(fù)制、感染以及誘導(dǎo)中和抗體活性中的功能還不清楚,同時在細胞內(nèi)如何對E蛋白進行折疊、修飾和裝配也不清楚。另外JEV在引起大腦炎癥風(fēng)暴的過程中,還有哪些潛在的蛋白會產(chǎn)生作用,也沒有得到完整的解答。本研究制備了Pr M/M的單克隆抗體,并通過間接ELISA、IFA、Western Blot等方法驗證單抗的生物學(xué)特性。同時,利用i TRAQ技術(shù)對JEV P3感染U251細胞的蛋白質(zhì)組進行了分析。具體研究內(nèi)容如... 

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【學(xué)位級別】：碩士

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摘要
Abstract
中英文縮略語表（Abbreviation）
第一章JEV文獻綜述
    1. 乙型腦炎的流行病學(xué)
        1.1 乙腦的流行特征
        1.2 乙腦的傳播媒介與易感群體
    2. 乙型腦炎病毒的生物學(xué)特性
        2.1 乙型腦炎病毒的病原性
        2.2 乙型腦炎病毒的生物學(xué)特性
        2.3 乙型腦炎病毒的結(jié)構(gòu)蛋白
        2.4 乙型腦炎病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白
        2.5 乙型腦炎病毒的理化特性
        2.6 乙型腦炎病毒的增殖特性
        2.7 乙型腦炎病毒的復(fù)制過程
    3. 乙型腦炎病毒的入侵和致病機理
    4. 乙型腦炎的臨床表現(xiàn)
    5. 乙型腦炎的病理變化
    6. 乙型腦炎的診斷
        6.1 血清學(xué)檢測
        6.2 病毒分離培養(yǎng)
        6.3 分子生物學(xué)檢測
    7. 乙型腦炎的防治及疫苗研究現(xiàn)狀
        7.1 滅活疫苗
        7.2 減毒活疫苗
第二章JEV M蛋白單克隆抗體的制備及特性分析
    1.前言
        1.1 單克隆抗體的原理
        1.2 單克隆抗體的應(yīng)用及發(fā)展
    2.研究目的與意義
    3. 材料與方法
        3.1 實驗材料
            3.1.1 質(zhì)粒、菌株、病毒、細胞和動物
            3.1.2 主要試劑、儀器和耗材
            3.1.3 抗生素及其配制方法
            3.1.4 主要培養(yǎng)基及其配制
            3.1.5 主要緩沖液（溶液）及其配制
        3.2 實驗方法與步驟
            3.2.1 M蛋白引物的設(shè)計
            3.2.2 M蛋白基因的擴增
            3.2.3 M蛋白基因片段的純化回收
            3.2.4 PCR回收產(chǎn)物及表達載體的處理
            3.2.5 目的基因與載體的連接
            3.2.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            3.2.7 重組質(zhì)粒的提取
            3.2.8 重組質(zhì)粒的鑒定
            3.2.9 重組質(zhì)粒p28a-sumo-M的誘導(dǎo)表達
            3.2.10 表達產(chǎn)物p28a-sumo-M的SDS-PAGE分析
            3.2.11 表達產(chǎn)物p28a-sumo-M的Western Blot分析
            3.2.12 不溶性包涵體蛋白純化方法
            3.2.13 動物免疫
            3.2.14 間接ELISA檢測方法的建立
            3.2.15 間接ELISA法檢測小鼠的免疫效價
            3.2.16 SP2/0 骨髓瘤細胞的制備
            3.2.17 免疫脾細胞的制備
            3.2.18 飼養(yǎng)細胞的制備
            3.2.19 細胞融合
            3.2.20 陽性雜交瘤細胞的篩選
            3.2.21 陽性雜交瘤細胞的亞克隆
            3.2.22 雜交瘤細胞的染色體計數(shù)
            3.2.23 單抗腹水的制備及抗體效價的測定
            3.2.24 單克隆抗體的純化
            3.2.25 單克隆抗體蛋白質(zhì)含量的測定
            3.2.26 單克隆抗體的亞型鑒定
            3.2.27 單克隆抗體的IFA分析
            3.2.28 單克隆抗體的Western Blot分析
            3.2.29 單克隆抗體靶抗原表位區(qū)域的分析
            3.2.30 小片段的原核表達
            3.2.31 單克隆抗體靶抗原表位的粗步判定
    4.結(jié)果與分析
        4.1 結(jié)果
            4.1.1 M基因片段PCR擴增及克隆質(zhì)粒的鑒定
            4.1.2 p28a-sumo-M重組蛋白的表達及純化
            4.1.3 M蛋白最佳抗原包被濃度的測定
            4.1.4 小鼠免疫效價的檢測
            4.1.5 雜交瘤細胞的篩選
            4.1.6 雜交瘤細胞遺傳性的穩(wěn)定分析
            4.1.7 單克隆抗體效價的檢測
            4.1.8 單克隆抗體亞型的檢測
            4.1.9 單克隆抗體的IFA分析
            4.1.10 單克隆抗體的Western Blot分析
            4.1.11 單克隆抗體靶抗原表位區(qū)域的分析
            4.1.12 小片段的原核表達分析
            4.1.13 M蛋白抗原表位的區(qū)域分析
    5. 討論與結(jié)論
        5.1 討論
            5.1.1 單抗的應(yīng)用前景
            5.1.2 蛋白表達
            5.1.3 動物免疫
            5.1.4 細胞融合
            5.1.5 單克隆抗體的篩選
            5.1.6 M蛋白靶抗原的鑒定
        5.2 小結(jié)
第三章 基于iTRAQ技術(shù)研究JEV P3 株感染U251 細胞的蛋白表達差異
    1. 前言
    2. 研究目的與意義
    3. 實驗材料與方法
        3.1 實驗材料
        3.2 實驗方法
            3.2.1 U251 細胞的復(fù)蘇
            3.2.2 病毒感染
            3.2.3 iTRAQ技術(shù)分析細胞樣品
            3.2.4 熒光定量引物的設(shè)計
            3.2.5 病毒總RNA的提取
            3.2.6 RT-PCR
            3.2.7 轉(zhuǎn)錄水平蛋白表達差異分析
            3.2.8 基因表達數(shù)據(jù)分析
    4. 實驗結(jié)果與分析
        4.1 實驗結(jié)果
            4.1.1 蛋白質(zhì)的鑒定
            4.1.2 GO分析
            4.1.3 差異蛋白定量信息的統(tǒng)計
            4.1.4 熒光定量分析差異蛋白質(zhì)的mRNA水平
    5. 討論與結(jié)論
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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本文編號：3665086